Detecção de Mycobacterium spp. como estratégia para o desenvolvimento de métodos moleculares para o diagnóstico da tuberculose

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dc.contributor.advisorOgatta, Sueli Fumie Yamada
dc.contributor.authorGonçalves, Guilherme Bartolomeu
dc.contributor.bancaVespero, Eliana Carolina
dc.contributor.bancaGomes, Lia Lima
dc.contributor.bancaFigueira, Mariana Brasil de Andrade
dc.contributor.bancaPelisson, Marsileni
dc.contributor.coadvisorPerugini, Marcia Regina Eches
dc.coverage.extent181 p.
dc.coverage.spatialLondrina
dc.date.accessioned2026-08-25T17:55:14Z
dc.date.available2026-08-25T17:55:14Z
dc.date.issued2025-09-30
dc.description.abstractA tuberculose é causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis — o qual possui espécies adaptadas aos animais e duas espécies adaptadas aos seres humanos: M. tuberculosis sensu stricto e Mycobacterium africanum. A doença ainda é estigmatizada e permanece como problema de saúde pública; sua epidemiologia é fortemente influenciada por condições socioeconômicas desfavoráveis, apresentando mortalidade significativa em escala global e nacional até os dias atuais. No Paraná mais de 2.300 casos novos foram reportados em 2023, dois quais 200 ocorreram em residentes de Londrina. A transmissão depende do contato com indivíduos com tuberculose ativa e o granuloma é o principal marco fisiopatológico, contribuindo para a cronicidade da infecção e a dificuldade terapêutica. O principal fator de risco é a imunosupressão. A vacinação é a principal estratégia profilática e o tratamento é longo e fundamentado na politerapia. Apesar de o cultivo ser o padrão-ouro para o diagnóstico da tuberculose, essa abordagem requer mais de três semanas para a liberação de resultados. Nesse sentido a Organização Mundial da Saúde (OMS) destaca a importância dos testes moleculares rápidos para a realização do diagnóstico precoce e início do tratamento, que efetivamente interrompe a transmissão da doença e contribui para a Estratégia pelo Fim da Tuberculose. No entanto, os testes comerciais recomendados pela OMS utilizam plataformas automatizadas que exigem equipamentos e insumos específicos e onerosos. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo otimizar uma qPCR in house para a detecção de Mycobacterium spp. Para isso, oligonucleotídeos iniciadores forward e reverse foram desenhados a partir da sequência consenso obtida após o alinhamento de 24 sequências do gene RNAr 16S de M. tuberculosis. Além disso, esse gene foi inserido no plasmídeo pUC57, que serviu como controle positivo para as reações de amplificação. Após a otimização das condições de amplificação por PCR convencional, a especificidade e sensibilidade analíticas foram determinadas por qPCR, e, posteriormente, o sistema de detecção foi validado em amostras biológicas. O par de iniciadores utilizado apresentou alta especificidade para o gênero, sem amplificação para outros microrganismos. A sensibilidade analítica foi de 10 cópias do controle positivo, indicando potencial para detecção de baixa carga bacilar. A validação com amostras biológicas mostrou concordância considerável com os resultados obtidos por métodos de referência, reforçando a aplicabilidade do sistema de detecção proposto, como ferramenta diagnóstica complementar. Dessa forma, o protocolo otimizado representa uma alternativa viável e de baixo custo para o diagnóstico molecular de tuberculose em contextos com recursos limitados, podendo contribuir para o enfrentamento da doença
dc.description.abstractother1Tuberculosis is caused by bacteria from the Mycobacterium tuberculosis complex — which includes species adapted to animals and two species adapted to humans: M. tuberculosis sensu stricto and Mycobacterium africanum. The disease remains stigmatized, and its epidemiology is strongly influenced by unfavorable socioeconomic conditions, still exhibiting significant mortality rates globally and nationally. In Paraná, more than 2,300 new cases were reported in 2023, of which 200 occurred in Londrina. The transmission depends on contact with individuals with active tuberculosis, and the granuloma is the main pathophysiological hallmark, contributing to the chronicity of the infection and therapeutic challenges. The primary risk factor is immunosuppression. The vaccination is the main prophylactic strategy, and treatment is long and based on polytherapy. Due to the advances in biomedical research, diagnostic approaches include bacilloscopy, immunological tests, pathogen culture, and molecular testing. Although culture remains the gold standard for tuberculosis diagnosis, it requires at least three weeks for result release. In this context, the World Health Organization (WHO) emphasizes the importance of rapid molecular tests for early diagnosis and initiation of treatment, which effectively interrupts disease transmission and contributes to the End TB Strategy. However, the commercial tests recommended by WHO use automated platforms that require specific and expensive equipment and supplies. Therefore, the present study aimed to optimize an in-house qPCR for the detection of Mycobacterium spp. For this, a pair of primers was designed based on the consensus sequence obtained after aligning 24 sequences of the 16S rRNA gene of M. tuberculosis. Additionally, this gene was inserted into the pUC57 plasmid, which served as a positive control for amplification reactions. After optimization the amplification conditions by conventional PCR, analytical specificity and sensitivity were determined by qPCR, and subsequently, the detection system was validated in biological samples. The primers used showed high specificity for the genus, with no amplification for other microorganisms. The analytical sensitivity was 10 copies of the positive control, indicating potential for detecting low bacillary loads. The validation with biological samples showed considerable agreement with results obtained by reference methods, reinforcing the applicability of the proposed detection system as a complementary diagnostic tool. Thus, the optimized protocol represents a feasible and low-cost alternative for molecular diagnosis of tuberculosis in resource-limited settings, potentially contributing to disease control efforts
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/19578
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCS - Departamento de Clínica Médica
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia Clínica e Laboratorial
dc.subjectTuberculose pulmonar
dc.subjectqPCR
dc.subjectDiagnóstico molecular
dc.subjectSaúde pública
dc.subjectReação em cadeia da polimerase em tempo real
dc.subjectTécnicas de diagnóstico molecular
dc.subject.capesCiências da Saúde - Medicina
dc.subject.cnpqCiências da Saúde - Medicina
dc.subject.keywordsPulmonary tuberculosis
dc.subject.keywordsqPCR
dc.subject.keywordsMolecular diagnosis
dc.subject.keywordsPublic health
dc.subject.keywordsReal-time polymerase chain reaction
dc.subject.keywordsMolecular diagnostic techniques
dc.titleDetecção de Mycobacterium spp. como estratégia para o desenvolvimento de métodos moleculares para o diagnóstico da tuberculose
dc.title.alternativeDetection of Mycobacterium spp. as a strategy for the development of molecular methods for tuberculosis diagnosis
dc.typeTese
dcterms.educationLevelDoutorado
dcterms.provenanceCentro de Ciências da Saúde

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