Caracterização fenotípica e molecular de mecanismos de resistência aos antimicrobianos e de fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa

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dc.contributor.advisorOgatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorPaula, Suelen Balero dept_BR
dc.contributor.bancaPicão, Renata Cristinapt_BR
dc.contributor.bancaGionco, Bárbarapt_BR
dc.contributor.bancaVenâncio, Emerson Josépt_BR
dc.contributor.bancaPelayo, Jacinta Sanchezpt_BR
dc.contributor.coadvisorMarroni, Floristher Elaine Carrara [Coorientadora]pt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T15:06:36Z
dc.date.available2024-05-01T15:06:36Z
dc.date.created2017.00pt_BR
dc.date.defesa18.12.2017pt_BR
dc.description.abstractResumo: Objetivo: O presente estudo teve como objetivo caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, quinolonas, aminoglicosídeos e colistina mediados por plasmídeos e diversos fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa Artigo científico 1: Uma coleção de duzentos e dez isolados de P aeruginosa não sensíveis à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram incluídos no estudo Os isolados foram recuperados no Laboratório de Microbiologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina (HU) no período de junho de 212 a maio de 214 A identificação bacteriana foi realizada pelo Vitek-2® (bioMéurieux) e por testes bioquímicos convencionais, seguida pela confirmação por PCR O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de disco-difusão para treze antimicrobianos A concentração inibitória mínima (CIM) à ceftazidima, aos carbapenêmicos e às polimixinas foi determinada pelo método de microdiluição em caldo Os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos foram interpretados segundo o documento M1-S27 (CLSI,217) e a classificação da resistência foi determinada segundo os critérios de Magiorakos (212) A produção de carbapenemases foi avaliada pelo Blue Carba Test (BCT) e a produção de metalo-beta-lactamases (MBL) foi determinada pelo Teste de Sinergismo de Disco Triplo (TSDT) A presença de genes codificadores de beta-lactamases, carbapenemases, Qnr, 16S rRNA metiltransferases e integrases foi investigada por PCR convencional ou multiplex seguida por sequenciamento A produção de fatores de virulência produzidos por P aeruginosa foi detectada entre os isolados produtores de carbapenemases utilizando testes fenotípicos Além disso, a capacidade de formação de biofilme foi avaliada em microplacas de poliestireno e os genes codificadores de fatores de virulência foram pesquisados por PCR A clonalidade dos isolados produtores de carbapenemases foi avaliada por ERIC-PCR e o Sequence Type (ST), de cinco isolados escolhidos aleatoriamente produtores de diferentes genes de carbapenemases e de clones distintos, foi determinado por Multilocus Sequence Typing (MLST) Altas taxas de resistência aos carbapenêmicos foram verificadas (8,9% para o imipenem e 78,% para o meropenem) e somente as polimixinas apresentaram 1,% de atividade contra todos os isolados do estudo Cerca de 54,7% dos isolados foram classificados como multirresistentes (MR) e 31,9% como extensivamente resistentes (ER) A produção de carbapenemases e de MBL foi detectada em 33,3% e 31,9% dos isolados pelo BCT e pelo TSDT, respectivamente Uma diversidade de genes codificadores de carbapenemases foi verificada entre 7 isolados: blaSPM-1 (63/3,%), blaKPC-2 (3/1,4%), blaIMP-16 (2/,9%), blaVIM-1 (1/,4%) e blaVIM-7 (1/,4%) Foram detectados genes codificadores de beta-lactamases (blaGES-26, blaOXA-46 e blaCTX-M-15) e de resistência aos aminoglicosídeos (rmtD) O gene blaIMP-16 foi detectado como o único gene cassete de um integron da classe I nos dois isolados produtores de IMP-16 O contexto genético dos genes blaVIM-1 e blaVIM-7 foram semelhantes: o gene codificador da MBL como o primeiro cassete gênico, seguido por uma enzima modificadora de aminoglicosídeos (aadA1) e o gene blaOXA-46 anteriormente ao qac?E/sulI Todos os isolados produtores de carbapenemases formaram biofilme e apresentaram o gene lasI codificador de um dos componentes do quorum sensing Um total de 98,6% e 94,3% foram produtores de hemolisinas e proteases, respectivamente Os genes que codificam a fosfolipase hemolítica (plcH), elastase (lasB), exotoxina A (toxA) e exotoxina S foram detectados em 94,3% dos isolados produtores de carbapenemases Apenas um e quatro isolados apresentaram os genes que codificam neuraminidase (nanI) e a exotoxina U, respectivamente A tipagem molecular dos isolados produtores de carbapenemases evidenciou grande diversidade clonal com a presença de 18 genótipos distintos, dos quais os isolados portadores de blaSPM-1 foram agrupados em 14 genótipos e os isolados portadores de blaKPC-2, blaIMP-16, blaVIM-1 e blaVIM-7 foram agrupados em clones únicos Diferentes STs foram obtidos para os cinco isolados submetidos ao MLST e dentre estes dois foram relacionados à disseminação de determinantes de resistência: o portador de blaSPM-1 pertenceu ao ST277, relacionado à disseminação de SPM-1 no Brasil e o portador de blaKPC-2 ao ST235, um importante clone epidêmico mundial Artigo científico 2: Este estudo relatou a primeira descrição de um isolado de P aeruginosa produtor de VIM-7 no Brasil O isolado foi recuperado em maio de 213 da secreção traqueal (17 UFC/mL) de um paciente internado no HU que apresentou resistência a todos os antimicrobianos, com exceção das polimixinas A produção de carbapenemases foi avaliada pelo BCT e a de MBL pelo TDST O gene blaVIM-7 foi localizado num plasmídeo de 52 Kb como o primeiro gene cassete de um integron da classe I seguido por um gene aadA1 e o blaOXA-46 situado anteriormente ao qac?E/sulI O isolado pertenceu ao ST1284, foi um forte produtor de biofilme e apresentou os genes codificadores de fatores de virulência lasI, lasB, plcH, toxA e exoS Artigo científico 3: O artigo relata a presença de um isolado de P aeruginosa produtor de KPC-2 pertencente ao ST235 em 28, anteriormente à primeira detecção do gene blaKPC no Brasil e de um surto de Enterobactérias produtoras de blaKPC no HU Este isolado foi recuperado da urina de uma paciente internada no setor de queimados do HU, foi classificado como ER e apresentou sensibilidade apenas às polimixinas A produção de carbapenemases foi detectada pelo BCT e o resultado negativo no TSDT caracterizou uma carbapenemase não MBL O gene blaKPC-2 apresentou localização cromossomal, em um contexto genético idêntico a isolados recuperados no HU em 21 O gene blaKPC-2 foi flanqueado à montante pela sequência de inserção ISKpn6, entretanto à jusante não foram detectadas ISKpn7 e ISKpn8 O isolado foi considerado hipervirulento, um forte formador de biofilme, produziu hemolisina e protease e apresentou os genes lasI, lasB, plcH, toxA, exoY e exoU Conclusões: As altas taxas de resistência aos antimicrobianos, a diversidade de genes codificadores de carbapenemases, a produção de importantes fatores de virulência e a detecção de STs relacionados a clones epidêmicos nacional e mundial refletem o problema da resistência aos antimicrobianos em P aeruginosa no HU Desta forma o estudo enfatiza a necessidade de medidas estritas de controle de infecção e de programas efetivos para o uso racional dos antimicrobianos neste hospitalpt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Objective: The aim of the present study was to characterize, by phenotypic and molecular methods, the resistance mechanisms to beta-lactams, quinolones, aminoglycosides and colistin mediated by plasmids and several virulence factors in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa Scientific article 1: A collection of two hundred and ten P aeruginosa isolates non-susceptible to ceftazidime and/or carbapenems were included in the study The isolates were recovered in the Clinical Microbiology Laboratory of the University Hospital of Londrina (HU) from June 212 to May 214 The bacterial identification was performed by Vitek-2® (bioMéurieux) and by conventional biochemical tests, followed by confirmation by PCR The antimicrobial susceptibility testing for thirteen antimicrobials was performed by the disc-diffusion method The minimum inhibitory concentration (MIC) to ceftazidime, carbapenems and polymyxins was determined by the broth microdilution method Antimicrobial susceptibility profiles were interpreted according to M1-S27 (CLSI, 217) and the resistance classification was determined according to the criteria of Magiorakos (212) The carbapenemase production was evaluated by the Blue Carba Test (BCT) and the metallo-beta-lactamase (MBL) production was determined by the Triple Disc Synergy Test (TSDT) The presence of beta-lactamases, carbapenemases, Qnr, 16S rRNA methyltransferases encoding genes and integrases were investigated by standard or multiplex PCR followed by sequencing The virulence factors produced by P aeruginosa were detected among the carbapenemase-producing isolates using phenotypic tests In addition, the biofilm formation capacity was evaluated on polystyrene microplates and the virulence factors encoding genes were screened by PCR The clonality of the carbapenemase-producing isolates was evaluated by ERIC-PCR and the Sequence Type (ST) of five randomly selected isolates harboring different carbapenemases genes and distinct clones were determined by Multilocus Sequence Typing (MLST) High rates of carbapenem resistance were observed (89% for imipenem and 78% for meropenem) and only polymyxins showed 1% activity against all isolates of this study Around 547% of the isolates were classified as multi-drug resistant (MDR) and 319% as extensively-drug resistant (XDR) The carbapenemases and MBL production were detected in 333% and 319% of the isolates by BCT and TSDT, respectively A variety of carbapenemase encoding genes was found among 7 isolates: blaSPM-1 (63/3%), blaKPC-2 (3/14%), blaIMP-16 (2/9%), blaVIM-1 (1/4%) and blaVIM-7 (1/4%) Beta-lactamase (blaGES-26, blaOXA-46 e blaCTX-M-15) and aminoglycoside resistance (rmtD) encoding genes were detected The blaIMP-16 was detected as the only cassette gene of the class I integron in the two IMP-16-producing isolates The genetic context of blaVIM-1 and blaVIM-7 genes were similar: the MBL encoding gene was the first gene cassette, followed by an aminoglycoside modifying enzyme (aadA1), and the blaOXA-46 gene prior to qac?E/sulI All the carbapenemase-producing isolates formed biofilm and harbored the lasI gene, a component of quorum sensing A total of 986% and 943% were hemolysin and protease producers, respectively The hemolytic phospholipase (plcH), elastase (lasB), exotoxin A (toxA) and exotoxin S (exoS) encoding genes were detected in 943% of the carbapenemase-producing isolates Only one and four isolates harbored the genes encoding for neuraminidase (nanI) and exotoxin U, respectively The molecular typing of the carbapenemase-producing isolates showed a high clonal diversity with the presence of 18 distinct genotypes, of which the blaSPM-1 isolates were grouped in 14 genotypes and the isolates harboring the blaKPC-2, blaIMP-16, blaVIM-1 and blaVIM-7 were assigned as single clones Different STs were obtained for the five isolates submitted to the MLST and among these two were related to resistance determinants spread: the blaSPM-1-harboring isolate belonged to ST277, related to the dissemination of SPM-1 in Brazil and the blaKPC-2-harboring isolate to ST235, an important worldwide epidemic clone Scientific article 2: This study reported the first description of a VIM-7-producing P aeruginosa isolate in Brazil The isolate was recovered in May 213 from a tracheal secretion (17 CFU/mL) of a patient hospitalized in HU The isolate was resistant to all antimicrobials, with the exception of polymyxins The production of carbapenemases was evaluated by BCT and MBL by TDST The blaVIM-7 was located on a 52 Kb plasmid, and was the first cassette gene of a class I integron followed by an aadA1 gene The blaOXA-46 was located prior to qac?E/sulI The isolate belonged to ST1284, was a strong biofilm producer and presented the lasI, lasB, plcH, toxA and exoS encoding genes Scientific article 3: The article reported the presence of a KPC-2-producing P aeruginosa isolate belonging to ST235 in 28, prior to the first blaKPC gene detection in Brazil and an outbreak of Enterobacteria harboring the blaKPC in HU This isolate was recovered from the urine of a patient hospitalized in HU The isolate was classified as XDR and showed susceptibility only to polymyxins The carbapenemase production was detected by the BCT and the negative result in the TSDT characterized a non-MBL carbapenemase The blaKPC-2 gene was flanked upstream by the ISKpn6 insertion sequence; however, no ISKpn7 and ISKpn8 were detected downstream The isolate was considered hypervirulent, a strong biofilm producing The isolate produced hemolysin and protease and harbored the lasI, lasB, plcH, toxA, exoY and exoU genes Conclusions: High antimicrobial resistance rates, diversity of carbapenemase encoding genes, production of important virulence factors, and detection of STs related to national and global epidemic clones reflect the problem of antimicrobial resistance in P aeruginosa in the HU Thus, the study emphasizes the need for strict infection control measures and effective programs for the rational use of antimicrobials in this hospitalpt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Microbiologia) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologiapt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/16368
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameMicrobiologiapt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Biológicaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Microbiologiapt_BR
dc.subjectPseudomonas aeruginosapt_BR
dc.subjectVirulência (Microbiologia)pt_BR
dc.subjectDrogaspt_BR
dc.subjectResistência em microorganismospt_BR
dc.subjectVirulence (Microbiology)pt_BR
dc.subjectDrug resistance in micro-organismspt_BR
dc.titleCaracterização fenotípica e molecular de mecanismos de resistência aos antimicrobianos e de fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosapt_BR
dc.typeTesept_BR

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