PCR multiplex para detecção de Salmonella spp e dos genes eae e IT de Escherichia coli em hortaliças orgânicas

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dataload.collectionmapped02 - Mestrado - Ciência de Alimentospt_BR
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dc.contributor.advisorOliveira, Tereza Cristina Rocha Moreira de [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorBonfante, Raissa Curtipt_BR
dc.contributor.bancaPelayo, Jacinta Sanchezpt_BR
dc.contributor.bancaMikcha, Jane Martha Gratonpt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T14:04:08Z
dc.date.available2024-05-01T14:04:08Z
dc.date.created2012.00pt_BR
dc.date.defesa31.05.2012pt_BR
dc.description.abstractResumo: Hortaliças orgânicas podem ser fontes de micro-organismos patogênicos, tais como Salmonella spp e Escherichia coli diarreiogênicas, que são causas frequentes de doenças de origem alimentar O gene invA codifica as proteínas de invasão celular de Salmonella spp, a adesina intimina, codificada pelo gene eae, é a proteína responsável pela aderência íntima de Escherichia coli enteropatogênica e Escherichia coli enterohemorrágica, e Escherichia coli enterotoxigênica produtoras de toxina LT, codificada pelo gene lt, são as mais frequentemente isoladas em humanos O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio PCR multiplex para detecção simultânea de Salmonella e dos genes eae e lt de E coli em hortaliças orgânicas Os pares de oligonucleotídeos iniciadores Styinva-JHO-2, eae e lt foram específicos e geraram produtos de amplificação de aproximadamente 119 pb, 218 pb e 384 pb para Salmonella spp, ETEC e EPEC, respectivamente O volume final de reação foi de 2 µL, contendo 4 µL de DNA alvo, 4 mM de MgCl2, ,6 mM de dNTPs, ,5 mM de StyinvaJHO2-R e StyinvaJHO2-F, ,3 mM de LT-R e LT-F, ,3 mM de eae-R e eae-F e 1 U de Taq DNA polimerase As condições de amplificação foram desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 6 s, hibridação a 6 °C por 6 s, polimerização da sequência alvo a 72 °C por 6 s e polimerização da sequência alvo final a 72 °C por 1 min Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose a 1,5% acrescidos de ,2 µL/mL de SYBR®Safe A especificidade do ensaio foi de 1 % e foi testada com culturas puras de diferentes sorovares de Salmonella e de outras espécies bacterianas O limite de detecção para cada uma das bactérias patogênicas testadas foi de 14 UFC/mL A PCRm padronizada foi testada com 12 amostras de hortaliças orgânicas comercializadas em feiras livres de Londrina, Paraná Paralelamente, essas mesmas 12 amostras foram avaliadas quanto a contaminação por Salmonella spp e E coli pelo método tradicional de cultura e placas PetrifilmTMEC, respectivamente Salmonella spp não foi isolada em nenhuma das amostras analisadas tanto pela cultura quanto pela PCRm Trinta e quatro amostras estavam contaminadas com E coli, com contagens que variavam de 12 UFC/g a 8, x 16 UFC/g Em uma das amostras positivas foi isolada E coli com gene lt e em uma outra amostra E coli com gene eae A PCRm padronizada é uma alternativa para a detecção em hortaliças orgânicas de Salmonella spp e dos genes lt e eae de Ecoli O ensaio pode ser utilizado como triagem para posterior identificação de outros fatores de virulência de E colipt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Organic vegetables can be sources of pathogenic microorganisms such as Salmonella and diarrheagenic Escherichia coli, that are frequent causes of foodborne illness The invA gene encodes of proteins of cellular invasion of Salmonella spp, the adhesin intimin, encoded by the gene eae, is the protein responsible for intimate adherence of enterohemorrhagic Escherichia coli and enteropathogenic Escherichia coli, enterotoxigenic Escherichia coli producing LT toxin, encoded by lt gene, are the most frequently isolated from humans the objective of this study was to develop a multiplex PCR assay (mPCR) for simultaneous detection of Salmonella and lt and eae genes of E coli in organic vegetables The pairs of primers Styinva-JHO-2, eae and lt were specific and generated amplification products of approximately 119pb, 218 pb and 384 pb for Salmonella spp, ETEC and EPEC, respectively The final volume of the reaction was 2 µL, containing 4 µl of DNA template, 4 mM of MgCl2, ,6 mM of dNTPs, 5 mM of StyinvaJHO2-R and StyinvaJHO2-F, 3 mM of lt-R and lt-F 3 mM of eae-R and eae-F, and 1U of Taq DNA polymerase Amplification conditions were initial denaturation at 95 oC for 5 min, followed by 35 cycles of denaturation at 95 oC for 6 s, annealing at 6 oC for 6 s, extention at 72 oC for 6 s and final extetion at 72 oC for 1 min The amplification products were visualized on agarose gel 15% plus 2 µL/mL of SYBR?safe The specificity of the assay was 1% and it was tested using pure cultures of different Salmonella serovars and other bacterial species The detection limit for each of the pathogenic bacteria tested was 14 CFU / mL The developed mPCR was tested with 12 samples of organic vegetables purchased from local retail market of Londrina, Parana, Brazil The samples were also analyzed for Salmonella spp and E coli using traditional culture method and PetrifilmTMEC plates, respectively Salmonella spp was not detected in any sample analyzed by both culture method and the mPCR Thirty-four samples were contaminated with E coli, with counts ranging from 12 CFU/g to 8x16 CFU / g In one of the positive samples was detected E coli with lt gene and in another sample E coli with the eae gene The developed mPCR is an alternative for detection of Salmonella spp and lt and eae genes of E coli from organic vegetables The assay can be used as screening for subsequent identification of other virulence factors of E colipt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/12927
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência de Alimentospt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.subjectAlimentospt_BR
dc.subjectMicrobiologiapt_BR
dc.subjectSalmonelosept_BR
dc.subjectReação em cadeia de polimerasept_BR
dc.subjectHortaliçaspt_BR
dc.subjectMicrobiologypt_BR
dc.subjectSalmonellosispt_BR
dc.subjectPolymerase chain reactionpt_BR
dc.subjectPathogenic microorganismspt_BR
dc.subjectVegetables - Foodpt_BR
dc.titlePCR multiplex para detecção de Salmonella spp e dos genes eae e IT de Escherichia coli em hortaliças orgânicaspt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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