PCR multiplex para detecção de Salmonella spp e dos genes eae e IT de Escherichia coli em hortaliças orgânicas
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Bonfante, Raissa Curti
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Resumo
Resumo: Hortaliças orgânicas podem ser fontes de micro-organismos patogênicos, tais como Salmonella spp e Escherichia coli diarreiogênicas, que são causas frequentes de doenças de origem alimentar O gene invA codifica as proteínas de invasão celular de Salmonella spp, a adesina intimina, codificada pelo gene eae, é a proteína responsável pela aderência íntima de Escherichia coli enteropatogênica e Escherichia coli enterohemorrágica, e Escherichia coli enterotoxigênica produtoras de toxina LT, codificada pelo gene lt, são as mais frequentemente isoladas em humanos O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio PCR multiplex para detecção simultânea de Salmonella e dos genes eae e lt de E coli em hortaliças orgânicas Os pares de oligonucleotídeos iniciadores Styinva-JHO-2, eae e lt foram específicos e geraram produtos de amplificação de aproximadamente 119 pb, 218 pb e 384 pb para Salmonella spp, ETEC e EPEC, respectivamente O volume final de reação foi de 2 µL, contendo 4 µL de DNA alvo, 4 mM de MgCl2, ,6 mM de dNTPs, ,5 mM de StyinvaJHO2-R e StyinvaJHO2-F, ,3 mM de LT-R e LT-F, ,3 mM de eae-R e eae-F e 1 U de Taq DNA polimerase As condições de amplificação foram desnaturação inicial a 95 °C por 5 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 6 s, hibridação a 6 °C por 6 s, polimerização da sequência alvo a 72 °C por 6 s e polimerização da sequência alvo final a 72 °C por 1 min Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose a 1,5% acrescidos de ,2 µL/mL de SYBR®Safe A especificidade do ensaio foi de 1 % e foi testada com culturas puras de diferentes sorovares de Salmonella e de outras espécies bacterianas O limite de detecção para cada uma das bactérias patogênicas testadas foi de 14 UFC/mL A PCRm padronizada foi testada com 12 amostras de hortaliças orgânicas comercializadas em feiras livres de Londrina, Paraná Paralelamente, essas mesmas 12 amostras foram avaliadas quanto a contaminação por Salmonella spp e E coli pelo método tradicional de cultura e placas PetrifilmTMEC, respectivamente Salmonella spp não foi isolada em nenhuma das amostras analisadas tanto pela cultura quanto pela PCRm Trinta e quatro amostras estavam contaminadas com E coli, com contagens que variavam de 12 UFC/g a 8, x 16 UFC/g Em uma das amostras positivas foi isolada E coli com gene lt e em uma outra amostra E coli com gene eae A PCRm padronizada é uma alternativa para a detecção em hortaliças orgânicas de Salmonella spp e dos genes lt e eae de Ecoli O ensaio pode ser utilizado como triagem para posterior identificação de outros fatores de virulência de E coli
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Palavras-chave
Alimentos, Microbiologia, Salmonelose, Reação em cadeia de polimerase, Hortaliças, Microbiology, Salmonellosis, Polymerase chain reaction, Pathogenic microorganisms, Vegetables - Food