Identificação e monitoramento de Lactobacillus plantarum em alimentos e humanos com uso de ferramentas moleculares

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dataload.collectionmapped01 - Doutorado - Ciência de Alimentospt_BR
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dc.contributor.advisorMiglioranza, Lúcia Helena da Silva [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorCosta, Giselle Aparecida Nobrept_BR
dc.contributor.bancaCastro-Gómez, Raúl Jorge Hernanpt_BR
dc.contributor.bancaGarcia, Sandrapt_BR
dc.contributor.bancaNeumann, Elisabethpt_BR
dc.contributor.bancaGarcia, José Eduardopt_BR
dc.contributor.bancaSartori, Danielept_BR
dc.contributor.bancaRoig, Salvador Massaguerpt_BR
dc.contributor.coadvisorBôas, Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas [Coorientadora]pt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T14:02:15Z
dc.date.available2024-05-01T14:02:15Z
dc.date.created2011.00pt_BR
dc.date.defesa04.07.2011pt_BR
dc.description.abstractResumo: Bactérias ácido lácticas (BAL), sobretudo do gênero Lactobacillus, apresentam grande importância na indústria de alimentos por seu efeito benéfico sobre o hospedeiro No entanto, o monitoramento destas bactérias em alimentos e no intestino humano é dificultado pela diversidade e por sua grande similaridade genética entre espécies Neste trabalho, o gene recA de bactérias lácticas e entéricas foi analisado usando o método de Neighbor-Joining, com o objetivo de estabelecer relações filogenéticas entre estes microrganismos A análise filogenética evidenciou agrupamentos distintos para BAL, enterobactérias e bifidobactérias As bactérias pertencentes ao grupo do Lactobacillus plantarum foram claramente discriminadas entre si Um par de iniciadores LPrecAF e LPrecAR com 23 e 18 pb foi selecionado e utilizado em reação em cadeia da polimerase (PCR) Isso permitiu detecção específica da espécie L plantarum, tanto em meio de cultura, como em amostras de alimentos O limite de detecção na PCR convencional foi de 1 × 13 UFC/mL para amostras de alimentos e 7 × 12 UFC/mL em meio de cultura Visando a avaliação do L plantarum no TGI humano, um leite fermentado contendo a espécie L plantarum Lp115 foi formulado e utilizado em um estudo clínico com humanos O produto se manteve química e microbiologicamente estável durante a estocagem sob refrigeração até 9 dias, com viabilidade na faixa de 9,39 a 8,66 Log1 UFC/mL, no início e final da estocagem O produto foi caracterizado como leite fermentado adoçado e aromatizado e se manteve dentro dos parâmetros exigidos pela legislação brasileira vigente O leite fermentado, foi inserido na dieta diária de 61 adultos saudáveis, visando avaliar a quantificação do microrganismo em amostras fecais durante variados períodos de consumo e pós consumo via PCR quantitativo em tempo real (qPCR), com uso de metodologia TaqMan® e análise de dados com base em quantificação relativa ?CT O DNA de uma espécie não comum no trato gastrointestinal (TGI) foi utilizado como DNA normalizador e o tempo zero, ou amostras não tratadas foram utilizadas como referência para efeito de quantificação relativa O limite de detecção do método qPCR para o microrganismo alvo, foi de 1 cópias do gene recA/reação e 8 x 11 UFC/reação para L plantarum Os indivíduos receberam dose diária de 2 x111 UFC/ dose de L plantarum, que foi detectado e quantificado em todos os períodos de consumo na ordem de 13 – 14 UFC/g fezes Com relação ao tempo zero todos os períodos de consumo foram significativos (P = ,1) Porém, 15 e 45 dias após interrupção da dieta, o lactobacilo não é detectado na microbiota fecal O tempo de consumo não apresentou relação significativa com a ocorrência do L plantarum nas fezes nas avaliações pós-consumo (P = ,9) A análise dos dados tanto em quantidade de UFC como em Nº de cópias do gene alvo apresentou alta correlação (r 1, p < ,1) As metodologias empregadas foram sensíveis e eficientes, tanto para discriminação quanto para quantificação da bactéria alvo, e podem ser utilizadas para monitoramento da espécie em alimentos ou em ambiente de microbiota complexa, como o TGI humanopt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Lactic acid bacteria (LAB), particularly those belonging to the genus Lactobacillus, have great importance in the food industry for their beneficial effect on the host However, monitoring of these bacteria in food and human gut is cumbersome due to the diversity and the high genetic similarity among species In this study, the recA gene of lactic acid and enteric bacteria was analyzed using the Neighbor-Joining method with the aim of establishing phylogenetic relationships among these organisms The phylogenetic analysis showed distinct clusters for LAB, enterobacteria and bifidobacteria Furthermore, bacteria belonging to the L plantarum group were clearly discriminated from each other One set primer LPrecAF LprecAR, with 23 and 18 bp, was selected and used in conventional PCR This allowed the specific detection of the L plantarum specie, both in culture media and in food samples The limit of detection in conventional PCR was 1 × 13 CFU / mL for food samples and 7 × 12 CFU / ml in culture medium To assess L plantarum in the human GIT, a fermented milk containing the species L plantarum Lp115 was formulated and used in a clinical study The fermented milk remained chemically and microbiologically stable during storage under refrigeration, within 9 days The L plantarum counting ranged from 939 to 866 Log1 CFU/mL at the beginning and at the end of the storage period, respectively The product was characterized as fermented milk sweetened and flavored and remained within the parameters required by Brazilian legislation The fermented milk, was inserted into the daily diet of 61 healthy adults to evaluate the quantification of microorganisms in fecal samples for varying periods of consumption and post consumption via real-time quantitative PCR (qPCR) using TaqMan® methodology and analysis data based on relative quantification ?CT The DNA of a species not common in the human gastrointestinal tract (GIT) was used as normalizing DNA Moreover, the time zero or untreated samples were used as reference for the purpose of relative quantification The detection limit to L plantarum on the qPCR method was 1 copies recA gene/ reaction and 8 x 11 CFU/reaction The subjects received daily dose with 2 × 111 CFU/dose of L plantarum, which was detected and quantified in all periods of ingestion about 13 – 14 CFU/g faeces L plantarum mean counts, from fecal microbiota obtained in each period of consumption, are significant as regarding time zero (P=1) xvii Nevertheless, 15 and 45 days after the ingestion the lactobacilli is not detected in the fecal microbiota The intake time also showed no significant (P=9) relationship with the occurrence of L plantarum in the after consumption The analyses between the methods of relative quantification in terms of CFU or number of gene copies showed high correlation (r 1, p <1) The methods used were sensitive and efficient, both for discrimination and for target bacteria quantification and may be used for monitoring the species in foods or in complex microbial environment such as the human GITpt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/12767
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência de Alimentospt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.subjectLactobacillus plantarumpt_BR
dc.subjectBactérias produtoras de ácido lácticopt_BR
dc.subjectReação em cadeia de polimerasept_BR
dc.subjectLeitept_BR
dc.subjectAnálisept_BR
dc.subjectLactobacilluspt_BR
dc.subjectLactic acid bacteriapt_BR
dc.subjectProbioticspt_BR
dc.subjectPolymerase chain reactionpt_BR
dc.subjectMilk - Gastrointestinal systempt_BR
dc.subjectAnalysispt_BR
dc.titleIdentificação e monitoramento de Lactobacillus plantarum em alimentos e humanos com uso de ferramentas molecularespt_BR
dc.typeTesept_BR

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