Identificação e monitoramento de Lactobacillus plantarum em alimentos e humanos com uso de ferramentas moleculares
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Resumo
Resumo: Bactérias ácido lácticas (BAL), sobretudo do gênero Lactobacillus, apresentam grande importância na indústria de alimentos por seu efeito benéfico sobre o hospedeiro No entanto, o monitoramento destas bactérias em alimentos e no intestino humano é dificultado pela diversidade e por sua grande similaridade genética entre espécies Neste trabalho, o gene recA de bactérias lácticas e entéricas foi analisado usando o método de Neighbor-Joining, com o objetivo de estabelecer relações filogenéticas entre estes microrganismos A análise filogenética evidenciou agrupamentos distintos para BAL, enterobactérias e bifidobactérias As bactérias pertencentes ao grupo do Lactobacillus plantarum foram claramente discriminadas entre si Um par de iniciadores LPrecAF e LPrecAR com 23 e 18 pb foi selecionado e utilizado em reação em cadeia da polimerase (PCR) Isso permitiu detecção específica da espécie L plantarum, tanto em meio de cultura, como em amostras de alimentos O limite de detecção na PCR convencional foi de 1 × 13 UFC/mL para amostras de alimentos e 7 × 12 UFC/mL em meio de cultura Visando a avaliação do L plantarum no TGI humano, um leite fermentado contendo a espécie L plantarum Lp115 foi formulado e utilizado em um estudo clínico com humanos O produto se manteve química e microbiologicamente estável durante a estocagem sob refrigeração até 9 dias, com viabilidade na faixa de 9,39 a 8,66 Log1 UFC/mL, no início e final da estocagem O produto foi caracterizado como leite fermentado adoçado e aromatizado e se manteve dentro dos parâmetros exigidos pela legislação brasileira vigente O leite fermentado, foi inserido na dieta diária de 61 adultos saudáveis, visando avaliar a quantificação do microrganismo em amostras fecais durante variados períodos de consumo e pós consumo via PCR quantitativo em tempo real (qPCR), com uso de metodologia TaqMan® e análise de dados com base em quantificação relativa ?CT O DNA de uma espécie não comum no trato gastrointestinal (TGI) foi utilizado como DNA normalizador e o tempo zero, ou amostras não tratadas foram utilizadas como referência para efeito de quantificação relativa O limite de detecção do método qPCR para o microrganismo alvo, foi de 1 cópias do gene recA/reação e 8 x 11 UFC/reação para L plantarum Os indivíduos receberam dose diária de 2 x111 UFC/ dose de L plantarum, que foi detectado e quantificado em todos os períodos de consumo na ordem de 13 – 14 UFC/g fezes Com relação ao tempo zero todos os períodos de consumo foram significativos (P = ,1) Porém, 15 e 45 dias após interrupção da dieta, o lactobacilo não é detectado na microbiota fecal O tempo de consumo não apresentou relação significativa com a ocorrência do L plantarum nas fezes nas avaliações pós-consumo (P = ,9) A análise dos dados tanto em quantidade de UFC como em Nº de cópias do gene alvo apresentou alta correlação (r 1, p < ,1) As metodologias empregadas foram sensíveis e eficientes, tanto para discriminação quanto para quantificação da bactéria alvo, e podem ser utilizadas para monitoramento da espécie em alimentos ou em ambiente de microbiota complexa, como o TGI humano
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Palavras-chave
Lactobacillus plantarum, Bactérias produtoras de ácido láctico, Reação em cadeia de polimerase, Leite, Análise, Lactobacillus, Lactic acid bacteria, Probiotics, Polymerase chain reaction, Milk - Gastrointestinal system, Analysis