Geração de hibridoma e imunoensaio empregando anticorpos monoclonais para detecção de toxinas naturais

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dc.contributor.advisorHirooka, Elisa Yoko
dc.contributor.authorYamashita, Cássia Reika Takabayashi
dc.contributor.bancaSabino, Mirna
dc.contributor.bancaCorrêa, Benedito
dc.contributor.bancaMachinski Junior, Miguel
dc.contributor.bancaItano, Eiko Nakagawa
dc.coverage.extent138 p.
dc.coverage.spatialLondrina
dc.date.accessioned2024-09-25T14:06:36Z
dc.date.available2024-09-25T14:06:36Z
dc.date.issued2013-09-02
dc.description.abstractO contínuo monitoramento através de método rápido confiável de alta sensibilidade, especificidade, precisão e econômico, é o procedimento preventivo apropriado visando redução da exposição humana e animal a toxinas naturais, com ênfase a micotoxinas e cianotoxinas. Em consideração ao papel destaque da imunoquímica como bioferramenta de escolha na detecção in loco de toxinas, o trabalho abrangeu inovação tecnológica desde desenvolvimento de hibridoma para produção de anticorpo monoclonal - AcM contra molécula não-imunogênica de baixa massa molecular, proliferação celular para produção de AcM, à padronização – otimização de imunoensaio indireto competitivo ic-ELISA para o controle de qualidade na cadeia produtiva. O desenvolvimento de hibridoma foi conduzido com microscistina LR – MC-LR, cianotoxina de ocorrência potencial em água eutrofizada. A proliferação celular de hibridoma AF.2 e ZEN.2 foi conduzido in vitro (meio RPMI 1640 e Hybridoma Serum Free Media – H-SFM). O AcM produzido foi purificado e, após padronização metodológica, aplicado na análise de aflatoxina (AF) e zearalenona (ZEA) por ic-ELISA e CLAE; a otimização da análise de desoxinivalenol (DON) foi conduzida com AcM previamente produzido por DON.3. A fusão celular para desenvolver hibridoma secretor de AcM contra MC-L foi testada com conjugado MC-LR-KLH (128 dias, sete injeções) e, MC-LR-BSA (49 dias, 4 injeções, obtendo 9 clones) em camundongo BALB/c fêmea. Estes procedimentos não geraram híbridos produtores de AcM com alta afinidade a MC-LR, testado por ic-ELISA. Este i-ELISA para seleção de clone foi estabelecido com: 1µg/mL de MC-LR-KLH; 0,1% de leite desnatado/PBS para bloqueio; AcM anti-MC-LR em PBST; anticorpo secundário em PBST (IgG anti-mouse conjugado com fosfatase, 1: 2000) e substrato para-nitro fenil fosfato - pNPP. Os híbridos AF.2 e ZEN.2 produziram AcM de alta especificidade, aliado a baixa reatividade cruzada contra micotoxinas (DON, OTA e ZEA ou AF). O produto de hibridoma AF.2, obtido em H-SFM, consistiu de AcM de alta pureza com teor proteico de 0,94 mg/mL, não ocorrendo o mesmo com hibridoma ZEN.2 em RPMI 1640 adicionado de 10 % de soro fetal (teor proteico de 2,06 mg/mL). O ic-ELISA visando aplicação no controle de qualidade foi desenvolvido com AcM produzido, sendo estabelecido para análise de AF total: 250 ng/mL de AFB1-BSA, 1:104 de AcM anti-AF (0,094 µg/mL), 1:2000 de IgG anti-mouse HPR e 0,1 % de BSA para bloqueio. A curva padrão (0 a 5 ng/mL de AFB1) apresentou coeficiente R2 de 0,996 e correlação de Pearson de -0,93. A aplicabilidade de AcM para análise de AF, DON e ZEA em milho foi avaliado perante interferência de matriz e recuperação. A interferência de matriz na análise de AF permaneceu semelhante a partir de diluição 1:5 (p>0,05), obtendo-se limite de detecção (LD) de 2 e quantificação (LQ) de 4,6 µg/Kg, com recuperação média de 113, 106 e 104 % nas concentração de 10, 20 e 40 µg/Kg, respectivamente (coeficiente de variação – CV 6 a 20 %). Analisando AF em 75 amostras de milho por ic-ELISA e CLAE, oito apresentaram-se positiva por ambos os métodos (razão ELISA/CLAE, 0,8 a 1,2). Cinco amostras positivas por CLAE foram negativas por ic-ELISA, devido à diferença no LD e LQ. O parâmetro estabelecido para análise de DON por ic-ELISA em milho, trigo e derivado (biscoito) foi: 2 µg/mL de DON-HS-OVA; 1:2000 de AcM anti-DON (10,9 µg/mL). O AcM produzido por hibridoma DON.3 permitiu análise de biscoito sem requerer diluição da matriz (LD 159,3 e LQ 370 µg/Kg), i.e., sensibilidade superior ao obtido para análise de milho (diluição 1:5; LD 302,8; LQ 589,3 µg/Kg). A recuperação de DON em biscoito artificialmente contaminado (500, 1000 e 2000 µg/Kg) foi de 95 a 106 % (CV 3 a 8 %); em milho, a mesma foi de 95 a 106 % (CV 7 a 11 %). Analisando DON em 29 amostras de biscoito por ic-ELISA e CLAE, o coeficiente de correlação (r) foi 0,72 (razão ELISA/CLAE, 0,4 a 15,8). Procedendo mesma análise em milho (75), cinco amostras apresentaram positivas por ambas as técnicas, embora 49 amotras foram quantificadas por CLAE (LQ de 30,4 µg/Kg) e 6 por ic-ELISA (LQ de 589,3 µg/Kg). Os parâmetros estabelecidos para análise de ZEA por ic-ELISA foram: 2,5 µg/mL ZEA-OVA e 1:200 de AcM anti-ZEA (10,3 µg/mL). A interferência de matriz na análise de ZEA em milho (LD 51,7 e LQ 93,2 µg/Kg) e biscoito (LD 9,7 e LQ 23,7 µg/Kg) foi semelhante a partir da diluição 1:5 (p>0,05), enquanto que o trigo requereu diluição a 1:10 (LD 33,5 e LQ 87 µg/Kg). A recuperação média em milho artificialmente contaminado variou de 98 a 108 % (CV 3 a 9 %); 97 a 112 % em trigo (CV 2 a 8 %), e em biscoito 96 a 102 % (CV 4 a 7 %). A análise de ZEA em milho (36 amostras) por ic-ELISA e CLAE apresentou r = 0,77. Considerando o limite máximo de 400 µg/Kg para ZEA pela legislação brasileira, 16 amostras de milho apresentaram nível superior determinado por ambas as técnicas, embora duas apresentassem valores distintos (509,3 vs 218,8 µg/Kg e 388,6 vs 430,3 µg/Kg, sendo ic-ELISA vs CLAE). Analisando ZEA em trigo (125) por ic-ELISA e CLAE, cinco apresentaram-se positivas, em relação a 74 amostras negativas. Analisando ZEA em biscoito, 9 amostras apresentaram-se positivas por ic-ELISA (31,3 a 95 µg/Kg), comparada a 21 positivas por CLAE (0,9 a 92,2 µg/Kg). O ic-ELISA desenvolvido com AcM produzido no Laboratório (hibridoma AF.2, ZEN.2 e DON.3) demonstraram estabilidade das microplacas sensibilizadas por pelo menos duas semanas a 10 °C, ratificando a aplicação na triagem rápida de micotoxinas na cadeia produtiva de alimentos.
dc.description.abstractother1The continuous monitoring through rapid, reliable, high sensitivity, specificity, precision, robustness and economic method is the appropriate preventive procedure aimed at reducing human and animal exposure to natural toxins, with emphasis on cyanotoxins and mycotoxins. Considering the prominent role of immunochemistry as chosen biotool for in situ detection of toxins, this work covered technological innovation since the development of hybridoma producer of monoclonal antibody - mAb against non-immunogenic molecule of low molecular mass, cell proliferation for mAb production, standardization – optimization of indirect competitive immunoassay - ic-ELISA for quality control in the production chain. The development of hybridoma was conducted using microscistin LR - MC-LR, cyanotoxin of potential occurrence in eutrophic water, due to great advances in the Brazilian agricultural production. The AF.2 and ZEN.2 hybridoma cell proliferation was conducted in vitro (RPMI 1640 and Hybridoma Serum Free Media - H-SFM). The mAb was produced and purified, and applied in analysis of aflatoxin (AF) and zearalenone (ZEA) by ic-ELISA and HPLC after standardization of method. Optimization of deoxynivalenol (DON) analysis was conducted with mAb previously produced by DON.3 stored at -20 ° C. The cell fusion carried out for developing hybridoma secreting MAb against MC-LR was tested in conjunction with MC-LR-KLH (128 days, seven injections), and MC-LR-BSA (49 days, 4 injection, getting 9 clones) in mouse BALB/c female. These procedures did not generate hybrids producing mAb with high affinity to MC-LR, tested by ic-ELISA. The i-ELISA for clone selection was established as: 1µg/mL MC-LR-KLH, 0.1% skimmed milk / PBS for blocking; mAb anti-MC-LR in PBST; second antibody in PBST (IgG anti-mouse conjugated with phosphatase, 1:2000) and substrate para-nitrophenyl phosphate-PNPP. The AF.2 and ZEN.2 hybrids produced high specificity MAbs coupled with low cross-reactivity against other group of mycotoxins. The product of AF.2 hybridoma obtained in H-SFM consisted of high purity MAbs with protein content of 0.94 mg/mL, which did not happen with hybridoma ZEN.2 in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal serum (protein content of 2.06 mg/mL). The ic-ELISA aiming application in quality control was developed with produced MAb, being established for the analysis of total AF: 250 ng/mL of AFB1-BSA, 1:104 mAb anti-AF (0.094 µg/mL), 1:2000 anti-mouse IgG-HPR and 0.1% BSA for blocking. The standard curve (0 to 5 ng/mL of AFB1) presented coefficient of prediction (R2) of 0.996 and Pearson's correlation (r) of -0.93. The applicability of MAb for analysis of AF, DON and ZEA in corn was evaluated against matrix interference and recovery. The matrix interference analysis was similar to AF from 1:5 dilution (p> 0.05) with limit of detection (LOD) of 2 and quantification (LOQ) of 4.6 µg/kg, average recovery of 113, 106 and 104% in concentrations of 10, 20 and 40 µg/kg, respectively (coefficient of variation - CV of 6 to 20%). By analyzing AF in 75 corn samples using ic-ELISA and HPLC, it was observed that eight resulted positive by both methods (ratio ELISA/HPLC, 0.8 to 1.2). Five positive samples by HPLC were negative by ic-ELISA due to the difference in the LOD and LOQ. The parameter set for DON analysis by ic-ELISA in corn, wheat and wheat products (biscuit) was: 2 µg/mL of DON-HS-OVA; 1:2000 MAb anti-DON (10.9 µg/mL). The mAb produced by DON.3 hybridoma allowed for analysing biscuit without requiring matrix dilution (LOD of 370 and LOQ of 159.3 µg/kg), i.e. higher sensitivity than obtained for analysis of corn (1:5 dilution; LOD of 302.8, LOQ of 589.3 µg/kg). Recovery of DON in biscuit artificially infected (500, 1000 and 2000 µg/kg) was between 95 to 106% (CV of 3 to 8%) whereas in corn, it was 95-106% (7 to 11% fo CV). Analyzing DON in 29 samples of biscuit by ic-ELISA and HPLC, the correlation coefficient was 0.72 (ratio ELISA/HPLC 0.4 to 15.8). For the same analysis on corn (75), five samples were positive with both techniques, although 49 samples were quantified by HPLC (LOQ of 30.4 µg/Kg) and 6 samples by ic -ELISA (LOQ of 589.3 µg/Kg). The parameters set for analysis by ZEA ic-ELISA were: 2.5 µg/mL of ZEA-OVA and anti-ZEA MAb 1:200 (10.3 µg/mL). The matrix interference analysis of ZEA in corn (LOD of 51.7 and LOQ of 93.2 µg/Kg) and biscuit (LOD of 9.7 LD and LQ 23.7 of µg/Kg) were similar from the 1:5 dilution (p> 0.05), while the wheat required 1:10 dilution (LD of 33.5 and LQ of 87 µg kg).The average recovery in artificially contaminated corn ranged from 98 to 108% (CV 3 to 9%), 97 and 112% for wheat (CV 2 to 8%), and 96 to 102% (CV 4 to 7%) for biscuit. Analysis of ZEA in maize (36 samples) by ic-ELISA and HPLC showed a correlation coefficient of 0.77. Considering the maximum ZEA established by Brazilian legislation, 16 corn samples had levels exceeding 400 µg/Kg for both techniques, although two samples presented different values in the analysis (509.3 vs 218.8 µg/Kg and 388.6 vs. 430.3 µg/Kg, for ic-ELISA vs. HPLC, respectively). Analysis of ZEA in wheat (125) by ic-ELISA and HPLC showed five positive results, while they presented 74 negative samples. Analyzing ZEA in biscuit, 9 samples were tested positive by ic-ELISA (31.3 to 95 µg/Kg), compared to 21 positive by HPLC (0.9 to 92.2 µg/Kg). The ic-ELISA developed with mAb produced in the laboratory (hybridoma AF.2, ZEN.2 and DON.3) showed stability of sensibilized microplate at least two weeks at 10 °C confirming the application in the rapid screening of mycotoxins in the food chain.
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/17750
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCA - Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
dc.subjectHibridoma
dc.subjectAnticorpo monoclonal
dc.subjectImunensaio
dc.subjectMicotoxinas
dc.subjectMicrocistina
dc.subject.capesCiências Agrárias - Ciência e Tecnologia de Alimentos
dc.subject.cnpqCiências Agrárias - Ciência e Tecnologia de Alimentos
dc.subject.keywordsHybridoma
dc.subject.keywordsMonoclonal antibody
dc.subject.keywordsImmunoassay
dc.subject.keywordsMycotoxins
dc.subject.keywordsMicrocystin
dc.titleGeração de hibridoma e imunoensaio empregando anticorpos monoclonais para detecção de toxinas naturais
dc.title.alternativeHybridoma generation and immunoassay employing monoclonal antibodies for natural toxins detection
dc.typeTese
dcterms.educationLevelDoutorado
dcterms.provenanceCentro de Ciências Agrárias

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