Geração de hibridoma e imunoensaio empregando anticorpos monoclonais para detecção de toxinas naturais
Data
2013-09-02
Autores
Yamashita, Cássia Reika Takabayashi
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Resumo
O contínuo monitoramento através de método rápido confiável de alta sensibilidade, especificidade, precisão e econômico, é o procedimento preventivo apropriado visando redução da exposição humana e animal a toxinas naturais, com ênfase a micotoxinas e cianotoxinas. Em consideração ao papel destaque da imunoquímica como bioferramenta de escolha na detecção in loco de toxinas, o trabalho abrangeu inovação tecnológica desde desenvolvimento de hibridoma para produção de anticorpo monoclonal - AcM contra molécula não-imunogênica de baixa massa molecular, proliferação celular para produção de AcM, à padronização – otimização de imunoensaio indireto competitivo ic-ELISA para o controle de qualidade na cadeia produtiva. O desenvolvimento de hibridoma foi conduzido com microscistina LR – MC-LR, cianotoxina de ocorrência potencial em água eutrofizada. A proliferação celular de hibridoma AF.2 e ZEN.2 foi conduzido in vitro (meio RPMI 1640 e Hybridoma Serum Free Media – H-SFM). O AcM produzido foi purificado e, após padronização metodológica, aplicado na análise de aflatoxina (AF) e zearalenona (ZEA) por ic-ELISA e CLAE; a otimização da análise de desoxinivalenol (DON) foi conduzida com AcM previamente produzido por DON.3. A fusão celular para desenvolver hibridoma secretor de AcM contra MC-L foi testada com conjugado MC-LR-KLH (128 dias, sete injeções) e, MC-LR-BSA (49 dias, 4 injeções, obtendo 9 clones) em camundongo BALB/c fêmea. Estes procedimentos não geraram híbridos produtores de AcM com alta afinidade a MC-LR, testado por ic-ELISA. Este i-ELISA para seleção de clone foi estabelecido com: 1µg/mL de MC-LR-KLH; 0,1% de leite desnatado/PBS para bloqueio; AcM anti-MC-LR em PBST; anticorpo secundário em PBST (IgG anti-mouse conjugado com fosfatase, 1: 2000) e substrato para-nitro fenil fosfato - pNPP. Os híbridos AF.2 e ZEN.2 produziram AcM de alta especificidade, aliado a baixa reatividade cruzada contra micotoxinas (DON, OTA e ZEA ou AF). O produto de hibridoma AF.2, obtido em H-SFM, consistiu de AcM de alta pureza com teor proteico de 0,94 mg/mL, não ocorrendo o mesmo com hibridoma ZEN.2 em RPMI 1640 adicionado de 10 % de soro fetal (teor proteico de 2,06 mg/mL). O ic-ELISA visando aplicação no controle de qualidade foi desenvolvido com AcM produzido, sendo estabelecido para análise de AF total: 250 ng/mL de AFB1-BSA, 1:104 de AcM anti-AF (0,094 µg/mL), 1:2000 de IgG anti-mouse HPR e 0,1 % de BSA para bloqueio. A curva padrão (0 a 5 ng/mL de AFB1) apresentou coeficiente R2 de 0,996 e correlação de Pearson de -0,93. A aplicabilidade de AcM para análise de AF, DON e ZEA em milho foi avaliado perante interferência de matriz e recuperação. A interferência de matriz na análise de AF permaneceu semelhante a partir de diluição 1:5 (p>0,05), obtendo-se limite de detecção (LD) de 2 e quantificação (LQ) de 4,6 µg/Kg, com recuperação média de 113, 106 e 104 % nas concentração de 10, 20 e 40 µg/Kg, respectivamente (coeficiente de variação – CV 6 a 20 %). Analisando AF em 75 amostras de milho por ic-ELISA e CLAE, oito apresentaram-se positiva por ambos os métodos (razão ELISA/CLAE, 0,8 a 1,2). Cinco amostras positivas por CLAE foram negativas por ic-ELISA, devido à diferença no LD e LQ. O parâmetro estabelecido para análise de DON por ic-ELISA em milho, trigo e derivado (biscoito) foi: 2 µg/mL de DON-HS-OVA; 1:2000 de AcM anti-DON (10,9 µg/mL). O AcM produzido por hibridoma DON.3 permitiu análise de biscoito sem requerer diluição da matriz (LD 159,3 e LQ 370 µg/Kg), i.e., sensibilidade superior ao obtido para análise de milho (diluição 1:5; LD 302,8; LQ 589,3 µg/Kg). A recuperação de DON em biscoito artificialmente contaminado (500, 1000 e 2000 µg/Kg) foi de 95 a 106 % (CV 3 a 8 %); em milho, a mesma foi de 95 a 106 % (CV 7 a 11 %). Analisando DON em 29 amostras de biscoito por ic-ELISA e CLAE, o coeficiente de correlação (r) foi 0,72 (razão ELISA/CLAE, 0,4 a 15,8). Procedendo mesma análise em milho (75), cinco amostras apresentaram positivas por ambas as técnicas, embora 49 amotras foram quantificadas por CLAE (LQ de 30,4 µg/Kg) e 6 por ic-ELISA (LQ de 589,3 µg/Kg). Os parâmetros estabelecidos para análise de ZEA por ic-ELISA foram: 2,5 µg/mL ZEA-OVA e 1:200 de AcM anti-ZEA (10,3 µg/mL). A interferência de matriz na análise de ZEA em milho (LD 51,7 e LQ 93,2 µg/Kg) e biscoito (LD 9,7 e LQ 23,7 µg/Kg) foi semelhante a partir da diluição 1:5 (p>0,05), enquanto que o trigo requereu diluição a 1:10 (LD 33,5 e LQ 87 µg/Kg). A recuperação média em milho artificialmente contaminado variou de 98 a 108 % (CV 3 a 9 %); 97 a 112 % em trigo (CV 2 a 8 %), e em biscoito 96 a 102 % (CV 4 a 7 %). A análise de ZEA em milho (36 amostras) por ic-ELISA e CLAE apresentou r = 0,77. Considerando o limite máximo de 400 µg/Kg para ZEA pela legislação brasileira, 16 amostras de milho apresentaram nível superior determinado por ambas as técnicas, embora duas apresentassem valores distintos (509,3 vs 218,8 µg/Kg e 388,6 vs 430,3 µg/Kg, sendo ic-ELISA vs CLAE). Analisando ZEA em trigo (125) por ic-ELISA e CLAE, cinco apresentaram-se positivas, em relação a 74 amostras negativas. Analisando ZEA em biscoito, 9 amostras apresentaram-se positivas por ic-ELISA (31,3 a 95 µg/Kg), comparada a 21 positivas por CLAE (0,9 a 92,2 µg/Kg). O ic-ELISA desenvolvido com AcM produzido no Laboratório (hibridoma AF.2, ZEN.2 e DON.3) demonstraram estabilidade das microplacas sensibilizadas por pelo menos duas semanas a 10 °C, ratificando a aplicação na triagem rápida de micotoxinas na cadeia produtiva de alimentos.
Descrição
Palavras-chave
Hibridoma, Anticorpo monoclonal, Imunensaio, Micotoxinas, Microcistina