Navegando por Autor "Paula, Suelen Balero de"
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Item Análise da atividade sinérgica entre beta-lactâmicos e anticorpos IgY específicos contra Pseudomonas aeruginosa multirresistentesSanches, Renata Fernandes; Venâncio, Emerson José [Orientador]; Paula, Suelen Balero de; Fernandes, Eduardo VignotoResumo: Pseudomonas aeruginosa é um bacilo gram-negativo responsável por infecções hospitalares A emergência de bactérias multirresistentes, como P aeruginosa, não é acompanhada pela descoberta de novas classes de antimicrobianos que possam combater de modo efetivo e seguro as infecções causadas por esses patógenos A imunoglobulina Y (IgY), obtida a partir da gema do ovo de galinhas, é considerada uma importante ferramenta tecnológica na pesquisa e na imunoterapia Anticorpos IgY tem propriedades antimicrobianas já comprovadas em estudos in vitro sendo seu uso investigado como adjuvante em terapias profiláticas Tendo em vista a importância clínica de P aeruginosa multirresistentes aos antimicrobianos, este estudo teve como objetivo avaliar a ação sinérgica entre os anticorpos IgY anti-P aeruginosa e antimicrobianos pertencentes a classe dos beta-lactâmicos Para isso, os anticorpos IgY foram obtidos a partir do método de precipitação com sulfato de amônia Em seguida, os anticorpos IgY foram esterilizados, quantificados pelo método de Bradford e sua pureza investigada por SDS-PAGE 1% As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) dos beta-lactâmicos imipenem, meropenem e ceftazidima foram obtidas pelo método de microdiluição em caldo e a atividade antimicrobiana dos anticorpos IgY através do teste de inibição Em seguida, realizou-se o teste de sensibilidade in vitro a antimicrobianos em combinação com IgY Os anticorpos IgY específicos anti-P aeruginosa produtora de SPM-1 apresentam atividade antimicrobiana a partir de 1,25 mg/ml e anticorpos IgY anti-P aeruginosa produtora de VIM-2 apresentam melhor atividade antimicrobiana a partir de 2,5 mg/ml Quando avaliada a atividade sinérgica entre anticorpos IgY e cada beta-lactâmico selecionado, observou-se sinergismo nos momentos 48 e 72 horas Concluímos que existe uma ação sinérgica entre anticorpos IgY específicos contra P aeruginosa e que novos estudos devem ser feitos para investigar os mecanismos associados a essa açãoItem Candida spp. isoladas da mucosa bucal de pacientes portadores de HIV : identificação, expressão de fatores de virulência e sensibilidade às substâncias antifúngicasPaula, Suelen Balero de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Bizerra, Fernando César; Almeida, Ricardo Sérgio Couto deResumo: A introdução da terapia antirretroviral associada aos inibidores de protease (IP) reduziu a ocorrência de infecções oportunistas em indivíduos portadores do HIV (Human immunodeficiency virus) Contudo, a candidíase orofaríngea continua sendo a infecção fúngica oportunista mais frequente nesses indivíduos A sensibilidade variada e a emergência de isolados resistentes aos antifúngicos entre essas espécies reforçam a necessidade de um diagnóstico microbiológico específico para essas infecções Além disso, a resistência apresentada pelo biofilme à maioria dos fármacos justifica o estudo de novas substâncias com potencial antifúngico Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi identificar, e caracterizar leveduras isoladas da cavidade bucal de pacientes HIV positivos quanto a: sensibilidade a nistatina e fluconazol; expressão dos fatores de virulência; efeito do eugenol sobre células planctônicas e sésseis de Candida dubliniensis e Candida tropicalis Amostras de enxágue bucal de 244 pacientes foram utilizadas nesse trabalho Do total de pacientes, 5,41% estavam colonizados por Candida spp, sendo que 11 pacientes apresentaram co-colonização por duas espécies Candida albicans (1) foi a espécie mais prevalente, correspondendo a 74,1% dos isolados Outras espécies foram isoladas de 35 pacientes, sendo 27 C glabrata, 2 C krusei, 3 C tropicalis e 3 C dubliniensis A maioria dos isolados (59,26%) foi considerada sensível ao fluconazol, 22,96% e 18,52% dos isolados foram considerados sensíveis dose-dependente e resistentes ao fluconazol, respectivamente A maioria dos isolados (86,7%) apresentou CIM entre 2 e 4 µg/mL e 14,15% apresentaram entre 8 e 128 µg/mL para a nistatina A média relativa de HSC (hidrofobicidade da superfície celular) analisada pelo método bifásico, utilizando xileno como hidrocarboneto, foi de 63,47 ± 21,48 e a maioria dos isolados (54,81%) foi classificada como altamente hidrofóbicos Todos os isolados foram capazes de formar biofilme na superfície de poliestireno, entretanto foi observada maior atividade metabólica em biofilmes formados por isolados de C tropicalis Cinco isolados não apresentaram atividade proteolítica em presença de albumina de soro bovino (BSA), entretanto 48,89%, 36,29% e 11,11% apresentaram alta, intermediária e baixa atividade de protease, respectivamente Somente 36,29% dos isolados apresentaram atividade de fosfolipases extracelulares em presença de gema de ovo como substrato A hemólise completa de sangue de carneiro foi observada em apenas 17,4% dos isolados Foi possível verificar, por PCR em tempo real, uma redução significativa na expressão das SAP2 de C albicans isoladas de pacientes em tratamento com os IP quando comparados com aqueles sem esse tratamento O eugenol apresentou atividade sobre células planctônicas, sobre a formação de biofilme e biofilme maduro, sendo que o tratamento com o eugenol reduziu drasticamente a quantidade de células sobre as superfícies O tratamento com o eugenol foi capaz de reduzir a CSH, a adesão em células Hep-2 e em poliestireno Além disso, o tratamento com o eugenol reprimiu a expressão dos genes ALS Os resultados corroboram a importância da identificação e análise do perfil de sensibilidade aos antifúngicos para o planejamento terapêutico adequado para cada pacienteItem Caracterização de determinantes de resistência adquirida aos antimicrobianos e de genes de virulência em isolados clínicos e ambientais de Pseudomonas spp. multirresistentesPalermo, Raquel Lima; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Tognim, Maria Cristina Bronharo; Paula, Suelen Balero de; Carrara-Marroni, Floristher Elaine [Coorientador]Resumo: O surgimento de isolados de Pseudomonas spp multirresistentes aos antimicrobianos (MR-PS) é um problema de saúde pública, uma vez que a maioria dos determinantes de resistência aos antimicrobianos são adquiridos e podem ser disseminados entre isolados, em diversos ambientes, por meio da transferência lateral de genes O objetivo desta pesquisa foi realizar a vigilância epidemiológica de MR-PS no ambiente hospitalar e comunitário contribuindo para o controle de infecções hospitalares no Hospital Universitário de Londrina (HU) Foram analisadas a presença de genes que codificam resistência adquirida aos antimicrobianos e virulência, e a relação clonal entre os isolados A identificação e o perfil de resistência foram, primeiramente, realizados pelo sistema automatizado Vitek-2 (BioMéuriex®) para os isolados clínicos e por testes bioquímicos convencionais para os isolados ambientais seguido por identificação molecular baseada em análises do gene 16S rRNA para espécies de Pseudomonas Os genes codificadores de resistência aos beta-lactâmicos e carbapenêmicos de classe A, B e D de Ambler, quinolonas (qnr), aminoglicosídeos (rmt) e colistina (mcr-1) foram pesquisados por PCR e a identidade confirmada por sequenciamento O contexto dos genes codificadores de carbapenemases foi investigado por PCR-mapping e a relação clonal entre os isolados foi analisada por ERIC-PCR Um total de 198 isolados clínicos recuperados entre os anos de 215 e 216 foram selecionados para o estudo com base nos seguintes critérios: isolados únicos, consecutivos e não sensíveis a ceftazidima e/ou imipenem e meropenem Além disso, foram incluídos no presente trabalho sete isolados ambientais de MR-PS produtores de carbapenemases, os quais foram recuperados de efluentes e faziam parte de uma coleção de isolados de Pseudomonas spp do Laboratório de estudos moleculares e resistência aos antimicrobianos (LEMRA) do Ambulatório de Especialidades do HU (AEHU) Com exceção das polimixinas (1,% sensíveis), altas taxas de resistência foram obtidas para todos os antimicrobianos testados Taxas preocupantes foram detectadas para os carbapenêmicos em isolados clínicos: 81,5% e 82,5% para imipenem e meropenem, respectivamente Dentre os 198 isolados clínicos MR-PS, 38 (19,2%) apresentaram genes codificadores de beta-lactamases, dos quais 32 (16,1%) apresentaram genes codificadores de carbapenemases Desta forma, a nova distribuição dos genes codificadores de beta-lactamases foi: em 14 isolados o gene blaSPM-1, seguido por 1 isolados carreando o gene blaKPC-2, 2 blaIMP-16, 6 blaCTX-M-2 e 6 blaGES-5, indicando um aumento da taxa de isolados portadores de blaKPC e uma redução de isolados portadores de blaSPM em comparação com as pesquisas anteriores Os genes investigados que codificam resistência às quinolonas, aminoglicosídeos e colistina não foram detectados neste estudo Os 32 isolados clínicos de MR-PS que apresentaram genes de carbapenemases foram agrupados em 12 clones (A-L) distribuídos ao longo do período analisado em diversas unidades hospitalares Os isolados que carreiam o gene blaSPM-1 foram agrupados em um único clone (A), sugerindo uma disseminação clonal e que este clone A é o responsável pela manutenção desse determinante de resistência no HU Os isolados codificadores de blaIMP-16 foram agrupados em 2 clones que diferiram fenotipicamente do clone que se manteve no hospital por 1 anos caracterizado pela sensibilidade ao meropenem Dentre os 1 isolados portadores do gene blaKPC-2, obtiveram-se 7 clones revelando a adaptação deste determinante de resistência em nosso hospital, provavelmente movido pela pressão seletiva do uso de carbapenêmicos A presença de uma nova carbapenemase do tipo GES-5 foi detectada em 6 isolados pertencentes a um mesmo clone (B) Todos os isolados exibiram um padrão de genes de virulência que condiz com sua a capacidade patogênica, porém não apresentaram correlação com a produção de carbapenemases, mas podem estar relacionados a clones epidêmicos mundiais Os isolados ambientais apresentaram-se clonalmente distintos dos isolados clínicos, representando 7 clones diferentes (A-G) condizendo com a diversidade esperada em isolados ambientais Além disso, a frequência de genes de virulência foi menor, revelando uma menor capacidade patogênica quando comparado aos isolados clínicos A presença de isolados produtores de carbapenemases recuperados de efluentes é alarmante uma vez que este ambiente é caracterizado pela notável capacidade de disseminação da resistência Além disso, esses resultados mostram que as taxas e a distribuição dos genes de resistência adquirida aos antimicrobianos podem flutuar em uma instituição e que a sua vigilância é essencial para estabelecer as medidas de controle de infecção para resguardar a eficácia dos antimicrobianos no tratamento de infecções por Pseudomonas sppItem Caracterização fenotípica e molecular de mecanismos de resistência aos antimicrobianos e de fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosaPaula, Suelen Balero de; Ogatta, Sueli Fumie Yamada [Orientador]; Picão, Renata Cristina; Gionco, Bárbara; Venâncio, Emerson José; Pelayo, Jacinta Sanchez; Marroni, Floristher Elaine Carrara [Coorientadora]Resumo: Objetivo: O presente estudo teve como objetivo caracterizar, por métodos fenotípicos e moleculares, mecanismos de resistência aos beta-lactâmicos, quinolonas, aminoglicosídeos e colistina mediados por plasmídeos e diversos fatores de virulência em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa Artigo científico 1: Uma coleção de duzentos e dez isolados de P aeruginosa não sensíveis à ceftazidima e/ou aos carbapenêmicos foram incluídos no estudo Os isolados foram recuperados no Laboratório de Microbiologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina (HU) no período de junho de 212 a maio de 214 A identificação bacteriana foi realizada pelo Vitek-2® (bioMéurieux) e por testes bioquímicos convencionais, seguida pela confirmação por PCR O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado pelo método de disco-difusão para treze antimicrobianos A concentração inibitória mínima (CIM) à ceftazidima, aos carbapenêmicos e às polimixinas foi determinada pelo método de microdiluição em caldo Os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos foram interpretados segundo o documento M1-S27 (CLSI,217) e a classificação da resistência foi determinada segundo os critérios de Magiorakos (212) A produção de carbapenemases foi avaliada pelo Blue Carba Test (BCT) e a produção de metalo-beta-lactamases (MBL) foi determinada pelo Teste de Sinergismo de Disco Triplo (TSDT) A presença de genes codificadores de beta-lactamases, carbapenemases, Qnr, 16S rRNA metiltransferases e integrases foi investigada por PCR convencional ou multiplex seguida por sequenciamento A produção de fatores de virulência produzidos por P aeruginosa foi detectada entre os isolados produtores de carbapenemases utilizando testes fenotípicos Além disso, a capacidade de formação de biofilme foi avaliada em microplacas de poliestireno e os genes codificadores de fatores de virulência foram pesquisados por PCR A clonalidade dos isolados produtores de carbapenemases foi avaliada por ERIC-PCR e o Sequence Type (ST), de cinco isolados escolhidos aleatoriamente produtores de diferentes genes de carbapenemases e de clones distintos, foi determinado por Multilocus Sequence Typing (MLST) Altas taxas de resistência aos carbapenêmicos foram verificadas (8,9% para o imipenem e 78,% para o meropenem) e somente as polimixinas apresentaram 1,% de atividade contra todos os isolados do estudo Cerca de 54,7% dos isolados foram classificados como multirresistentes (MR) e 31,9% como extensivamente resistentes (ER) A produção de carbapenemases e de MBL foi detectada em 33,3% e 31,9% dos isolados pelo BCT e pelo TSDT, respectivamente Uma diversidade de genes codificadores de carbapenemases foi verificada entre 7 isolados: blaSPM-1 (63/3,%), blaKPC-2 (3/1,4%), blaIMP-16 (2/,9%), blaVIM-1 (1/,4%) e blaVIM-7 (1/,4%) Foram detectados genes codificadores de beta-lactamases (blaGES-26, blaOXA-46 e blaCTX-M-15) e de resistência aos aminoglicosídeos (rmtD) O gene blaIMP-16 foi detectado como o único gene cassete de um integron da classe I nos dois isolados produtores de IMP-16 O contexto genético dos genes blaVIM-1 e blaVIM-7 foram semelhantes: o gene codificador da MBL como o primeiro cassete gênico, seguido por uma enzima modificadora de aminoglicosídeos (aadA1) e o gene blaOXA-46 anteriormente ao qac?E/sulI Todos os isolados produtores de carbapenemases formaram biofilme e apresentaram o gene lasI codificador de um dos componentes do quorum sensing Um total de 98,6% e 94,3% foram produtores de hemolisinas e proteases, respectivamente Os genes que codificam a fosfolipase hemolítica (plcH), elastase (lasB), exotoxina A (toxA) e exotoxina S foram detectados em 94,3% dos isolados produtores de carbapenemases Apenas um e quatro isolados apresentaram os genes que codificam neuraminidase (nanI) e a exotoxina U, respectivamente A tipagem molecular dos isolados produtores de carbapenemases evidenciou grande diversidade clonal com a presença de 18 genótipos distintos, dos quais os isolados portadores de blaSPM-1 foram agrupados em 14 genótipos e os isolados portadores de blaKPC-2, blaIMP-16, blaVIM-1 e blaVIM-7 foram agrupados em clones únicos Diferentes STs foram obtidos para os cinco isolados submetidos ao MLST e dentre estes dois foram relacionados à disseminação de determinantes de resistência: o portador de blaSPM-1 pertenceu ao ST277, relacionado à disseminação de SPM-1 no Brasil e o portador de blaKPC-2 ao ST235, um importante clone epidêmico mundial Artigo científico 2: Este estudo relatou a primeira descrição de um isolado de P aeruginosa produtor de VIM-7 no Brasil O isolado foi recuperado em maio de 213 da secreção traqueal (17 UFC/mL) de um paciente internado no HU que apresentou resistência a todos os antimicrobianos, com exceção das polimixinas A produção de carbapenemases foi avaliada pelo BCT e a de MBL pelo TDST O gene blaVIM-7 foi localizado num plasmídeo de 52 Kb como o primeiro gene cassete de um integron da classe I seguido por um gene aadA1 e o blaOXA-46 situado anteriormente ao qac?E/sulI O isolado pertenceu ao ST1284, foi um forte produtor de biofilme e apresentou os genes codificadores de fatores de virulência lasI, lasB, plcH, toxA e exoS Artigo científico 3: O artigo relata a presença de um isolado de P aeruginosa produtor de KPC-2 pertencente ao ST235 em 28, anteriormente à primeira detecção do gene blaKPC no Brasil e de um surto de Enterobactérias produtoras de blaKPC no HU Este isolado foi recuperado da urina de uma paciente internada no setor de queimados do HU, foi classificado como ER e apresentou sensibilidade apenas às polimixinas A produção de carbapenemases foi detectada pelo BCT e o resultado negativo no TSDT caracterizou uma carbapenemase não MBL O gene blaKPC-2 apresentou localização cromossomal, em um contexto genético idêntico a isolados recuperados no HU em 21 O gene blaKPC-2 foi flanqueado à montante pela sequência de inserção ISKpn6, entretanto à jusante não foram detectadas ISKpn7 e ISKpn8 O isolado foi considerado hipervirulento, um forte formador de biofilme, produziu hemolisina e protease e apresentou os genes lasI, lasB, plcH, toxA, exoY e exoU Conclusões: As altas taxas de resistência aos antimicrobianos, a diversidade de genes codificadores de carbapenemases, a produção de importantes fatores de virulência e a detecção de STs relacionados a clones epidêmicos nacional e mundial refletem o problema da resistência aos antimicrobianos em P aeruginosa no HU Desta forma o estudo enfatiza a necessidade de medidas estritas de controle de infecção e de programas efetivos para o uso racional dos antimicrobianos neste hospital