01 - Doutorado - Fisiopatologia Clínica e Laboratorial

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Associação entre as variantes genéticas rs10157379 e rs10754558 do NLRP3 com a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1, aterosclerose subclínica e marcadores inflamatórios
(2025-04-14) Bellinati, Philipe Quagliato; Reiche, Edna Maria Vissoci; Simão, Andrea Name Colado; Alfieri, Daniela Frizon; Amarante, Marla Karine; Oliveira, Carlos Eduardo Coral de; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti
Introdução: Os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória associada à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) não são totalmente compreendidos. Eles são multifatoriais e, entre os componentes da resposta imune inata, tem-se os inflamassomas. Inflamassomas são componentes multiproteicos da resposta imune inata que contribuem para a sinalização inflamatória na infecção pelo HIV-1. Entre os inflamassomas, o NLRP3 é o mais estudado e variantes nos genes que codificam as suas proteínas têm sido associadas a suscetibilidade a agentes infecciosos e/ou desenvolvimento de complicações graves durante infecções. A variante NLRP3 rs10754558 C>G, localizada na região 3’não traduzida (3’UTR), foi associada à proteção contra a infecção pelo HIV-1; no entanto, os resultados são conflitantes e escassos para outras variantes, como a NLRP3 rs10157379 T>C. Além disto, o advento da terapia antirretroviral combinada (TARV) eficaz permitiu que pessoas vivendo com HIV-1 e aids (PVHA) tivessem expectativas de vida significativamente prolongadas, com diminuição da morbidade e mortalidade associadas à infecção pelo HIV-1. No entanto, esses indivíduos sofrem de inflamação sistêmica crônica cuja etiologia multifatorial está associada a várias comorbidades, entre elas as doenças cardiovasculares e aterosclerose. Ainda assim, os dados sobre a correlação entre a ativação do inflamassoma e os marcadores de aterosclerose em PVHA são limitados. Objetivo: Determinar a associação entre as variantes genéticas rs10157379 T>C e rs10754558 C>G do NLRP3 e a infecção pelo HIV-1, aterosclerose subclínica, carga viral do HIV-1 e marcadores da resposta inflamatória e metabólica em um grupo de indivíduos infectados pelo HIV-1. Métodos: Neste estudo caso-controle, foram inseridos 78 PVHA, em uso de TARV há, pelo menos, cinco anos, atendidos no Ambulatório de Especialidades do Hospital Universitário da Universidade Estadual de Londrina (AEHU/UEL). Como grupo controle, foram avaliados 147 indivíduos saudáveis provenientes do Hemocentro Regional de Londrina e da população geral. A ultrassonografia doppler (USGD) de carótida foi realizada nos indivíduos que foram, posteriormente, categorizados de acordo com a espessura da íntima-média da carótida (cIMT) em <0,9 ou =0,9 mm, grau de estenose (<50,0 ou = 50,0%) e presença de placa (=1,5 mm). Dados demográficos, fatores de estilo de vida e história médica foram coletados pela avaliação clínica e aplicação de um questionário padrão. Biomarcadores inflamatórios e metabólicos foram avaliados como contagem de leucócitos periféricos, contagem de plaquetas, níveis plasmáticos de proteína C reativa com método ultrassensível (usPCR), perfil lipídico, níveis de glicose, ferritina, homocisteína, adiponectina, interleucina (IL)-6, IL-10 e fator de necrose tumoral (TNF)-a. Além disso, foram avaliadas a contagem de linfócitos T CD4+, T CD8+e a quantificação plasmática do RNA do HIV-1. As variantes NLRP3 rs10157379 T>C e rs10744558 C>G foram determinadas a partir do DNA genômico usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real. A associação entre variantes genéticas e infecção pelo HIV-1 foi avaliada em modelos genéticos codominantes, recessivos, dominantes e superdominantes usando regressão logística. Razão de chances [odds ratio (OR)] e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) foram avaliados com ajuste para potenciais fatores de confusão. Resultados: Artigo 1: As PHVA eram mais velhas que os controles (p=0,028), 39 (50,0%) eram do sexo feminino (OR: 1,10; IC95%: 0,63-1,90, p=0,734) e 41 (52,6%) eram não caucasianos (OR: 1,96; IC95%: 1,12-3,43, p=0,017). Não foi observada associação entre as variantes rs10744558 e rs10157379 do NLRP3 e a infecção pelo HIV-1 em todos os modelos genéticos. Para a variante rs10157379, a distribuição dos genótipos no modelo codominante (TT, TC e CC) foi semelhante entre os grupos (p=0,932 para TC e p=0,733 para CC). Da mesma forma, para a variante rs10754558, a distribuição dos genótipos CC, GC e GG não mostrou diferença entre as PHVA e controles (p=0,290 para CG e p=0,309 para GG). Análises adicionais usando os modelos dominante, recessivo e superdominante também não mostraram associação significativa entre essas variantes e a suscetibilidade ao HIV-1. Artigo 2: Entre as PHVA 39 (50,0%) eram do sexo feminino e 37 (47,4%) eram caucasianos. A cIMT = 0,9 mm estava presente em 34 (43,6%) PHVA. O modelo univariado revelou uma associação entre c-IMT (= 0,9 mm) e sexo masculino (p=0,006), não caucasianos (p=0,001), uso de inibidor de transcriptase reversa análogo de nucleosídeo (INTR) (p=0,001), inibidor de protease (IP) (p=0,002), medicamentos anti-hipertensivos (p=0,018), medicamentos hipolipemiantes (p=0,009), tabagismo (p=0,043), estilo de vida sedentário (p=0,012), presença de síndrome metabólica (p=0,011) e contagem de células T CD4 < 500 células/mm3 (p=0,013). Comparadas com as PHVA com cIMT <0,9 mm, as PHVA com cIMT = 0,9 mm eram mais velhas (p=0,027), apresentavam aumento de homocisteína (p=0,017), ferro (p=0,049), IL-10 (p=0,039) e diminuição de lipoproteína do colesterol de alta densidade (HDL-C) (p=0,039). No entanto, todas as variáveis perderam a significância no modelo de regressão logística, indicando que não estavam associadas com a cIMT. A cIMT não foi associada às variantes do NLRP3. Além disso, as PHVA portadoras da homozigose para o alelo variante G da NLRP3 rs10754555 apresentaram maior frequência de carga viral indetectável do que aquelas portadoras dos genótipos CC + CG. Conclusão: Os resultados indicam que as variantes NLRP3 rs10744558 e rs10157379 não estão associadas à infecção pelo HIV-1 e com a presença de aterosclerose subclínica nas PHVA em uso de TARV. No entanto, PHVA portadoras da homozigose para o alelo variante G da NLRP3 rs10754555 apresentaram maior frequência de carga viral indetectável do que aquelas portadoras dos genótipos CC + CG. Um ponto forte do estudo é que, pela primeira vez, o papel das variantes NLRP3 rs10157379 T>C e rs10754558 C>G foi avaliado na fisiopatologia da aterosclerose subclínica associada à infecção pelo HIV-1.
Associação entre exposição parental aos agrotóxicos e perfil clínico das leucemias agudas pediátricas na prole
(2026-07-20) Silva, Kennia Cristine de Souza; Panis, Carolina; Oliveira, Carlos Eduardo Coral de; Reiche, Edna Maria Vissoci; Pellissier, Fernanda Tomiotto; Victorino, Vanessa Jacob; Amarante, Marla Karine
A leucemia aguda pediátrica é uma doença multifatorial cuja etiologia envolve a interação entre fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. Entre os fatores ambientais, a exposição parental aos agrotóxicos tem sido apontada como um potencial fator de risco para a leucemogênese. Entretanto, permanecem limitadas as evidências sobre sua influência nas características clinicopatológicas e na resposta ao tratamento das leucemias agudas pediátricas. Diante disso, esta tese teve como objetivo investigar a associação entre a exposição parental aos agrotóxicos, as características clinicopatológicas e os desfechos terapêuticos das leucemias agudas na prole. Esta tese foi desenvolvida em dois artigos científicos. No primeiro artigo, realizou-se uma revisão sistemática da literatura, conduzida conforme as recomendações do Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA 2020) e registrada no International Prospective Register of Systematic Reviews (PROSPERO). Foram pesquisadas as bases PubMed e Web of Science, abrangendo estudos publicados entre 2012 e 2025. Dos 312 estudos identificados, 14 atenderam aos critérios de elegibilidade e foram incluídos na revisão. Os resultados demonstraram que a maioria dos estudos encontrou associação entre a exposição parental aos agrotóxicos e maior risco de leucemia na prole, principalmente quando a exposição ocorreu nos períodos pré-concepcional, gestacional e perinatal. Além disso, as evidências apontaram que alterações epigenéticas, estresse oxidativo, danos ao DNA e instabilidade cromossômica constituem mecanismos biológicos potencialmente envolvidos na leucemogênese, destacando a necessidade de estudos que elucidem essas vias fisiopatológicas. No segundo artigo, realizou-se um estudo observacional, descritivo e transversal com 40 crianças e adolescentes (0–17 anos) diagnosticados com leucemia linfoblástica aguda ou leucemia mieloide aguda, atendidos no Hospital do Câncer de Londrina, Paraná. A exposição ocupacional e ambiental parental aos agrotóxicos foi investigada por meio de questionário validado aplicado às mães, enquanto as informações clínicas, laboratoriais, genéticas e terapêuticas foram obtidas dos prontuários médicos das crianças e adolescentes. Os resultados evidenciaram elevada frequência de exposição parental, principalmente relacionada à proximidade de áreas agrícolas, ao contato ocupacional ou doméstico e à aplicação direta de agrotóxicos. Em contrapartida, a exposição parental aos agrotóxicos esteve associada à persistência da doença residual mínima no D28, indicando resposta terapêutica inicial menos favorável. Em conjunto, os resultados desta tese reforçam as evidências de que a exposição parental aos agrotóxicos constitui um importante fator ambiental relacionado às leucemias agudas pediátricas. A revisão sistemática consolidou as evidências da associação entre essa exposição e o risco de desenvolvimento da doença, enquanto o estudo clínico original demonstrou sua associação com um prognóstico inicial menos favorável, evidenciado pela persistência da doença residual mínima. Embora os achados não permitam estabelecer uma relação de causalidade, eles reforçam a necessidade de estudos multicêntricos, prospectivos e com maior número de participantes para confirmar essa associação, esclarecer os mecanismos biológicos envolvidos e ampliar o conhecimento sobre a influência da exposição parental aos agrotóxicos na leucemogênese e na resposta ao tratamento das leucemias agudas pediátricas
Avaliação da presença das mutações nos genes KRAS e EGFR e o envolvimento da expressão proteica do receptor CXCR4 em pacientes com câncer colorretal
(2024-02-23) Fernandes, Mayara Bocchi; Amarante, Marla Karine; Hirata, Bruna Karina Banin; Oliveira, Carlos Eduardo Coral de; Vitiello, Glauco Akelinghton Freire; Pereira, Nathália de Sousa; Oliveira, Karen Brajão de
O câncer colorretal (CCR) é uma doença multifacetada na qual ocorre um complexo processo de carcinogênese. Mutações nos genes KRAS e EGFR estão envolvidas no desenvolvimento e progressão do CCR, associadas a mau prognóstico e resistência a certas terapias. Além disso, o eixo CXCL12/CXCR4 e outras vias podem desempenhar papéis essenciais na criação de um ambiente de suporte para o avanço do tumor, evasão imunológica, angiogênese e metástase na carcinogênese do CCR. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar mutações nos genes KRAS e EGFR, perfil MSI e a expressão do receptor CXCR4 no CCR. Tratou-se de um estudo transversal, no qual foram avaliados 66 pacientes atendidos no Hospital do Câncer de Londrina (HCL), de ambos os sexos. A análise das mutações nos genes KRAS e EGFR foi realizada por meio de reação em cadeia da polimerase, seguida de restrição enzimática (PCR-RFLP) e a expressão de CXCR4 foi realizada através de imuno-histoquímica (IHQ). O HCL analisou a instabilidade de microssatélites através da expressão das proteínas de reparo de incompatilidade do DNA (MSH6, MSH2, MLH1, PMS2) por técnica de IHQ. Os demais parâmetros clinicopatológicos analisados, foram obtidos partir dos prontuários dos pacientes. A análise dos dados foi realizada por meio do coeficiente Tau de Kendall, adotando um nível de significância de 5%. A mediana da idade dos pacientes foi de 64 anos, com intervalo interquartil de 57,5 - 69,5 anos e 51,5% eram do sexo feminino. As frequências de mutações nos genes foram as seguintes: 40,9% no códon 12 de KRAS, 31,8% no códon 13 de KRAS e 1,5% no códon 21 do EGFR. Nenhum paciente apresentou mutação no códon 19 do EGFR. No presente estudo, a mutação no códon 13 de KRAS correlacionou-se com um maior estadiamento da doença (Tau = 0,259; p = 0,031), número de linfonodos regionais acometidos (Tau = 0,267; p = 0,040) e com a expressão de MSH6 (Tau = 0,174; p = 0,04). Já a mutação no códon 12 de KRAS, correlacionou-se com a idade avançada (Tau = 0,358; p = 0,006). Com relação a MSI, a maioria dos pacientes expressavam as proteínas de reparo de incompatibilidade do DNA, indicando uma estabilidade de microssatélites. Além disso, a expressão de MSH6 correlacionou-se com menor idade e a expressão de MLH1 e PSM2 correlacionou-se com um menor tamanho tumoral. Quanto ao perfil de imunomarcação do CXCR4, a expressão do receptor no tecido tumoral foi encontrada, em sua maioria, em pacientes positivos para o acometimento de linfonodos, com tamanho tumoral T3, estadiamento III, positivos para as proteínas de reparo de DNA e negativos para mutação nos códons 12 e 13 de KRAS. As mutações em genes associados com o processo de carcinogênese colorretal encontradas no presente estudo, estão diretamente relacionadas com condições clinicopatológicas mais avançadas da doença. Portanto, a utilização de biomarcadores na prática clínica faz-se importante para as decisões diagnósticas, prognósticas e preditivas do CCR, além de constituir a base da medicina personalizada.
Avaliação das variantes rs231775 e rs231779 do gene CTLA4 em pacientes com carcinoma urotelial de bexiga
(2023-09-20) Koike, Alexsandro; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Reiche, Edna Maria Vissoci; Rodrigues, Marco Aurélio de Freitas; Amarante, Marla Karine; Guembarovski, Roberta Losi; Simão, Andréa Name Colado
INTRODUÇÃO: O câncer de bexiga é o 10º tumor mais incidente e o 13º mais letal no mundo. O carcinoma urotelial de bexiga (CUB) é o tipo histológico mais freqüente, correspondendo a 90% dos casos. A quantidade de mutações somáticas de uma determinada sequência genômica de um tumor (TMB) comparada ao tecido normal varia em cada tipo de tumor. Os tumores com maiores TMB são o melanoma, seguido do carcinoma de não pequenas células do pulmão e o CUB. Esses tumores tendem a responder melhor ao tratamento imunoterápico. São exemplos de imunoterápicos, as drogas inibidoras de proteínas de ponto de checagem: a anti-proteína de morte programada-1(anti-PD-1); o anti-ligante da proteína de morte programada-1(PD-L1) e o anti-antígeno 4 do linfócito T-citotóxico (anti-CTLA-4). Esses imunoterápicos revolucionaram o tratamento do câncer nos últimos 10 anos. A maior ou menor expressão dessas proteínas na célula tumoral e nos linfócitos estão relacionadas ao prognóstico e resposta ao tratamento, sendo utilizados, também, como biomarcadores de resposta terapêutica. Entretanto, no CUB, parte dos biomarcadores disponíveis muitas vezes falha ao aferir o prognóstico e a eficácia do tratamento a ser realizado. O melhor entendimento dos efeitos das variantes genéticas de citocinas e da expressão de proteínas de ponto de checagem poderia servir como biomarcador do diagnóstico, prognóstico e/ou da decisão do tratamento. OBJETIVO: Buscar um melhor entendimento das diferentes variantes genéticas de citocinas relacionadas ao CUB, avaliar a frequência de 2 variantes genéticas do CTLA4 rs231775(+49AG) e rs231779(+1822CT) e relacionar com suscetibilidade e fatores prognósticos como o estadiamento da doença e a presença de metástases. SUJEITOS E MÉTODOS: Foi realizada uma revisão da literatura de variantes genéticas de citocinas relacionadas ao CUB seguindo as normas para revisões sistemáticas e meta-análises (PRISMA). Também foi realizado um estudo caso-controle, no qual foram selecionados 140 pacientes com diagnóstico de CUB submetidos a cirurgia, recrutados pelo Ambulatório de Urologia do Hospital do Câncer de Londrina, além de 145 indivíduos controle, provenientes de doadores de sangue do Hemocentro Regional de Londrina (CAAE: 17084619.2.0000.5231). Os dados clínicos foram obtidos por questionário aplicado a todos os participantes. Foram avaliadas as variantes genéticas do gene CTLA4(rs231775 e rs231779) por metodologia de reação em cadeia de polimerase em tempo real com sondas específicas tipo TaqMan®. RESULTADOS: Na revisão da literatura, encontramos 36 estudos caso-controle de variantes de citocinas relacionadas ao CUB. As variantes genéticas de IL27(rs153109), IL6(rs1800795), IFNG(rs62559044), IL2(rs2069762) e IL12(rs3212227), cujas expressões dessas variantes tendem a diminuir a produção dessas citocinas, mostraram aumento de risco e recorrência ao CUB. As variantes genéticas de TNFA(rs1800629, rs1799724 e rs1799964), IL22(rs2227485), IL31(rs4758680), IL32(rs12934561 e rs28372698), TGFB(rs1800470 e rs1800471), TGFBR1(rs868), IL4(rs2243248 e rs2243250), IL8(rs4073), IL10(rs1800896 e rs1800871), IL17(rs2275913, rs763780), IL23R(rs10889677 e rs188444), IL18(rs187283 e rs1946518) e IL13(rs1800925), cujas expressões dessas variantes tendem a elevar a produção dessas citocinas, mostraram aumento ao risco, da recorrência e da progressão tumoral ao CUB. As variantes genéticas do IL1(rs1143634 e rs16944), estudadas em 2 artigos, mostraram resultados divergentes em relação ao risco ao CUB. Em relação ao nosso estudo caso-controle realizado, verificamos que os genótipos heterozigotos no modelo overdominante do CTLA4 rs231775(+49AG) e rs231779(+1822CT) apresentaram diferenças significativas como fator protetor ao CUB. O genótipo codominante heterozigoto rs231779(+1822CT) também se mostrou como fator protetor ao CUB. Não identificamos diferenças estatísticas em relação a invasividade da camada muscular, da presença de metástases, do grupo de risco, da falha ao tratamento com o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) e da recorrência pós primeiro tratamento cirúrgico. O modelo de regressão logística utilizado na comparação entre indivíduos controle e CUB demonstrou que os genótipos homozigóticos das duas variantes, associados a idade e o tabagismo foram preditores da doença, explicando em 89,1% a presença do CUB. CONCLUSÃO: Os estudos das diversas variantes genéticas de citocinas demonstram que sua expressão no CUB apresenta uma ampla gama de resultados, nem sempre intuitiva, possivelmente justificada pelo pleiotropismo da ação das citocinas no sistema imune e no momento a qual suas ações interferem na carcinogênese do CUB. No estudo caso-controle realizado, propomos que os modelos polimórficos overdominantes do CTLA4 (rs231775 e rs231779), em conjunto com idade e tabagismo, podem servir como potenciais biomarcadores de suscetibilidade ao risco do CUB. As variantes genéticas do CTLA4 no CUB são pouco compreendidas e sua relação ainda há de ser esclarecida, necessitando de mais estudos para sua melhor compreensão.
Avaliação do efeito do tratamento com secuquinumabe e das variantes genéticas NLRP3 e IL18 do inflamassoma em pacientes com Espondiloartrites axiais
(2025-02-21) Ferreira, Meline Angélica Cunha Rotter; Simão, Andréa Name Colado; Amarante, Marla Karine; Costa, Neide Tomimura; Iriyoda, Tatiana Mayumi Veiga; Oliveira, Sayonara Rangel
INTRODUÇÃO A espondiloartrite axial (ax-EpA) representa um grupo de doenças inflamatórias crônicas que afetam principalmente a coluna vertebral e as articulações sacroilíacas. Elas são caracterizadas pela presença de dor inflamatória nas costas e rigidez. A fisiopatologia da ax-EpA é complexa e envolve uma combinação de fatores genéticos, ambientais e imunológicos. Dentre os fatores genéticos, destaca-se o alelo HLA-B27, que apresenta forte associação com o desenvolvimento da ax-EpA. Além disso, o inflamassoma nucleotide-binding domain (NOD)-like receptor protein 3 (NLRP3), um complexo proteico responsável pela ativação de citocinas pró-inflamatórias como a interleucina (IL)-1ß e a IL-18, desempenha um papel central na resposta imunológica inata e adaptativa, contribuindo para a inflamação crônica observada na ax-EpA. OBJETIVO: Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do secuquinumabe, um inibidor da IL-17A, em pacientes com espondiloartrite (EpA), com ou sem fibromialgia (FM), especialmente em casos sem resposta aos inibidores do fator de necrose tumoral (iTNF). Além disso, buscou investigar a influência das variantes nos genes NLRP3 e IL18 na suscetibilidade ao desenvolvimento da ax-EpA, atividade de doença e status do HLA-B27. SUJEITOS E MÉTODOS: Artigo 1: Ensaio clínico prospectivo com 22 pacientes diagnosticados com EpA que apresentaram falha terapêutica com iTNF e tinham indicação clínica para tratamento com secuquinumabe. Os pacientes foram posteriormente subdivididos de acordo com a positividade para HLA-B27 e a presença ou ausência de FM. As avaliações foram realizadas na linha de base (T0), 180 dias (T180) e 365 dias (T365), utilizando as métricas Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS), Bath Ankylosing Spondylitis Metrology Index (BASMI) e Maastricht Ankylosing Spondylitis Enthesitis Score (MASES). Os níveis de PCR de alta sensibilidade (usPCR) foram determinados por imunoturbidimetria, ferritina por imunoensaio quimioluminescente, velocidade de hemossedimentação (VHS) por automação e HLA-B27 por imunofluorometria utilizando a plataforma LUMINEX®. Artigo 2: Estudo caso-controle que incluiu 103 pacientes diagnosticados com ax-EpA e 207 indivíduos controles saudáveis. As variantes nos genes NLRP3 (rs10754558 e rs10157379) e IL18 (rs187238, rs360717 e rs549908) foram analisadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) com ensaios de genotipagem TaqMan™. A atividade da doença foi avaliada por meio do Índice de Atividade da Espondilite Anquilosante de Bath (BASDAI), enquanto os marcadores inflamatórios foram medidos por PCR via imunoturbidimetria e VHS por automação. RESULTADOS: Artigo 1: Pacientes negativos para HLA-B27 apresentaram maiores reduções nos índices de atividade da doença (ASDAS) e na mobilidade da coluna (BASMI) após o tratamento com secuquinumabe, com reduções significativas em T180 e T365 (p<0,001). Por outro lado, pacientes positivos para HLA-B27 demonstraram maior envolvimento entesítico (MASES). A presença de FM favoreceu a resposta ao tratamento, reduzindo o envolvimento entesítico ao longo do tempo (p<0,001). Artigo 2: O genótipo GG do NLRP3 (rs10754558) foi menos frequente em pacientes com ax-EpA em comparação com os controles (OR = 0,379, IC 95%: 0,147–0,974, p = 0,044). Já a variante NLRP3 T>C (rs10157379), não foi associada à ax-EpA. Além disso, ambas as variantes genéticas do NLRP3 não foram associadas à positividade para HLA-B27 e BASDAI. Em relação às variantes de IL18, não foi encontrada associação significativa com suscetibilidade à ax-EpA, positividade para HLA-B27 e BASDAI. CONCLUSÃO: Artigo 1: O tratamento com secuquinumabe mostrou-se eficaz em pacientes com EpA, particularmente em indivíduos negativos para HLA-B27 e/ou com FM, sugerindo que esses fatores devem ser considerados na tomada de decisão terapêutica. Artigo 2: Nossos dados mostraram que o genótipo GG do NLRP3 (rs10754558) confere aproximadamente 62,1% de proteção contra o desenvolvimento da ax-EpA,. Esses achados destacam o papel crítico da regulação do inflamassoma na patogênese da ax-EpA. Conclusão da tese: Juntos, esses achados reforçam que fatores genéticos e inflamatórios, como HLA-B27, NLRP3 e comorbidades como FM, são condições importantes para a personalização das abordagens diagnósticas e terapêuticas em pacientes com ax-EpA
Impacto da fase de indução da quimioterapia no perfil de mediadores inflamatórios sistêmicos e do microambiente tumoral na leucemia linfocítica aguda da infância
Oliveira, Geise Ellen Broto; Panis, Carolina [Orientador]; Venturini, Daniele; Amarante, Marla Karine; Victorino, Vanessa Jacob; Tomiotto-Pellissier, Fernanda
Resumo: A leucemia linfocítica aguda (LLA) é a principal neoplasia da infância cujo tratamento se baseia na poliquimioterapia dividida em fases (indução, consolidação e manutenção) A indução consiste em uma etapa determinante para o bom prognóstico dos pacientes portadores de LLA e no uso intensivo de drogas antineoplásicas combinadas no período de 28 dias, escalonados do dia (D - ao diagnóstico), ao dia 28 (D28 - final da fase de indução) Apesar do bom prognóstico da doença, com taxas de cura superiores a 8%, pouco se sabe sobre o impacto do tratamento no perfil de mediadores moleculares da inflamação, um hallmark do câncer descrito como determinante do comportamento biológico dos tumores A importância das proteínas e metabólitos produzidos na resposta inflamatória, como citocinas e mediadores do estresse oxidativo, tem sido discutida tanto no funcionamento normal da medula óssea, como na resposta à invasão medular pelos clones malignos Apesar disso, pouco se sabe sobre o impacto do tratamento quimioterápico sobre a dinâmica destes mediadores e de que forma isso pode influenciar tanto a resposta ao tratamento, como a imunopatogênese da LLA Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto da quimioterapia na fase de indução do tratamento da LLA sobre o perfil de mediadores inflamatórios produzidos sistemicamente e no microambiente tumoral em amostras de sangue de pacientes pediátricos diagnosticados com LLA do tipo B (LLA-B), comparando-se os perfis em D e D28 Para alcançar este objetivo, este estudo foi dividido em 2 etapas A primeira parte teve como objetivo traçar o perfil proteômico sistêmico e tumoral de amostras de sangue periférico (SP) e de medula óssea (MO) coletadas em D e D28, e validar possíveis proteínas de interesse ou vias de sinalização pouco conhecidas na LLA-B Na segunda etapa, avaliou-se o perfil de estresse oxidativo e de citocinas em amostras de SP e MO de pacientes com LLA-B também em D e D28 O estudo encontra-se cadastrado na Plataforma Brasil sob o número CAAE 244982135231 e foi aprovado pelo comitê de Ética Institucional Para ambas as etapas, foram recrutados 17 pacientes pediátricos atendidos no Instituto de Câncer de Londrina, entre setembro de 214 a dezembro de 216, com diagnóstico confirmado clínica e laboratorialmente para LLA-B, submetidos ao mesmo protocolo de tratamento Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido pelos responsáveis, e assentimento dos pacientes, foram coletadas amostras anticoaguladas de SP (5mL) e aspirado de MO (2 a 3 mL) em D e D28 As amostras foram centrifugadas para obtenção de plasma, onde foram realizadas as seguintes análises: investigação do perfil diferencial de proteínas por espectrometria de massa label-free, dosagem dos níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) e interferon gama (IFN-?) por enzimaimunoensaio (ELISA), dosagem de transtiretina por ensaio imunoturbidimétrico, determinação dos níveis dos metabólitos do óxido nítrico pela técnica de Cádmio-Cobre-Griess (NOx), determinação do conteúdo de grupos sulfidrila de proteínas (SH) baseado na reação do ácido 5,5-ditiobis-2 nitrobenzóico, determinação da capacidade antioxidante total plasmática (TRAP) e mensuração dos níveis de hidroperóxidos lipídicos por quimioluminescência Dados clínicos foram obtidos de consultas aos prontuários médicos e incluíram idade e peso ao diagnóstico, perfil do hemograma, acometimento de sistema nervoso central e testicular, dados de mielograma e avaliações sobre a presença de doença residual mínima (DRM) ao final do tratamento de indução Os dados obtidos foram analisados no software GraphPad Prism 7 (USA) e foi adotado o valor de p<,5 como significante Em relação ao estudo proteômico, em D o SP x MO, foi caracterizado como um ambiente pró-inflamatório, com a expressão das proteínas de coagulação cininogênio (KNG), plasmina e plasminogênio downreguladas D28 foi caracterizado pelos processos relacionados à resposta imunológica e a super expressão do IRF3 (activation of Interferon Regulatory Factor 3) e da proteína transtiretina O fator de transcrição da proteína leucemia mielóide aguda 1 (RUNX1) foi apontado como fator de transcrição comum tanto em D como em D28 As proteínas transtiretina e IFN-? foram validadas nas amostras e se mostraram aumentadas e diminuídas, respectivamente, em D28 Sobre o perfil de citocinas e de estresse oxidativo, observou-se que no D28 os níveis de TNF-a estavam aumentados no SP, enquanto que o IFN-? aumentou de modo significante apenas na MO Os hidroperóxidos aumentaram em D28 no SP de pacientes com DRM positiva Os resultados obtidos em ambos estudos permitem concluir que a transtiretina e IFN-? desempenham um papel importante nos mecanismos de resolução da LLA-B, e que os níveis de hidroperóxidos podem variar ao longo do tratamento de LLA na presença da DRM
Influência da suplementação de quercetina sobre parâmetros metabólicos, inflamatórios e estado redox em pacientes com doença de Crohn
(2026-03-18) Arceni, Beatriz Suellen; Venturini, Danielle; Lozovoy, Marcell Alysson Batisti; Perugini, Marcia Regina Eches; Amarante, Marla Karine; Oliveira, Sayonara Rangel
A Doença de Crohn (DC) é uma doença inflamatória intestinal crônica caracterizada por inflamação persistente da mucosa intestinal, alterações metabólicas e aumento do estresse oxidativo, decorrente da produção excessiva de espécies reativas de oxigênio. Apesar dos avanços terapêuticos, uma parcela significativa dos pacientes apresenta resposta inadequada ou perda de eficácia ao tratamento convencional, o que tem estimulado a investigação de estratégias terapêuticas complementares capazes de atuar em mecanismos adicionais da fisiopatologia da doença, como o estresse oxidativo (EO). Nesse contexto, a quercetina, um flavonoide amplamente presente em alimentos de origem vegetal, tem despertado interesse devido às suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. O objetivo geral desta tese foi de avaliar a influência da suplementação de quercetina na modulação dos marcadores metabólicos, inflamatórios e do estresse oxidativo em pacientes com doença de Crohn. Para isso, os resultados foram organizados em dois artigos científicos. O primeiro artigo consistiu em uma revisão sistemática que avaliou os efeitos da quercetina na DII, abordando estudos experimentais e clínicos disponíveis nos ultimos 10 anos. O segundo artigo correspondeu a um ensaio clínico cego por conveniencia e placebo-controlado, no qual 46 pacientes com DC foram alocados para receber suplementação com quercetina (n = 22) ou placebo (n = 24) por oito semanas, com análise de marcadores metabólicos, inflamatórios e de estresse oxidativo (EO). A revisão sistemática demonstrou que a quercetina apresenta potencial efeito antioxidante e anti-inflamatório, evidenciado principalmente em estudos experimentais, com redução de citocinas pró-inflamatórias como TNF-a; IL-1ß; IL-6 e INF-?, atenuação do dano oxidativo e preservação da integridade da mucosa intestinal. Entretanto, a revisão também evidenciou a escassez de estudos clínicos em humanos e a heterogeneidade metodológica dos trabalhos disponíveis, reforçando a necessidade de ensaios clínicos bem delineados. No ensaio clínico, embora alterações tenham sido observadas em ambos os grupos, a análise de delta revelou diferenças significativas entre o grupo quercetina e o grupo placebo, com aumento de produtos avançados de oxidação proteica no grupo placebo (p = 0,045) e ativação de componentes do sistema antioxidante no grupo suplementado com quercetina, especialmente do sistema glutationa, evidenciada pelo aumento da glutationa total (p = 0,008) e da glutationa reduzida (p = 0,002). Adicionalmente, análises de correlação no grupo quercetina indicaram associações significativas entre marcadores metabólicos, inflamatórios e parâmetros antioxidantes, sugerindo modulação do equilíbrio redox sistêmico. Em conjunto, os resultados desta tese indicam que a quercetina pode contribuir para a modulação do EO em pacientes com DC, especialmente por meio do fortalecimento de sistemas antioxidantes endógenos, como o sistema glutationa. Embora não tenham sido observadas diferenças clínicas marcantes em curto prazo, os achados reforçam o potencial da quercetina como estratégia adjuvante no manejo da doença e apontam para a necessidade de estudos futuros com maior duração e amostras mais amplas para a consolidação de seus efeitos clínicos
Mecanismos antiproliferativos do tratamento in vitro com trans-chalcona em linhagens de carcinoma cervical humano
(2023-09-28) Siqueira, Elaine da Silva; Panis, Carolina; Amarante, Marla Karine; Mantovani, Mário Sérgio; Oliveira, Karen Brajão de; Victorino, Vanessa Jacob
Moléculas derivadas de plantas medicinais tem sido fonte de pesquisa para novas terapias antineoplásicas como monoterapia ou terapia adjuvante. Neste estudo, investigamos o impacto do tratamento com trans-chalcona (TC) sobre duas linhagens celulares de diferentes tipos histológicos de carcinoma cervical, com destaque para o adenocarcinoma (HeLa) e carcinoma de células escamosas (SiHa). As linhagens foram tratadas com concentrações crescentes de trans-chalcona (6,25 - 100 µM) e a concentração inibitória de 50% das células (IC50) foi determinada em 28 µM (HeLa) e 23 µM (SiHa) em 24 horas. Para avaliar os mecanismos de ação envolvidos foram realizados ensaios para determinar a viabilidade celular por 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) e azul de tripan, microscopia de varredura (MEV) e transmissão (MET) para constatar alterações morfológicas e ultraestruturais, bem como os possíveis mecanismos de morte envolvidos e análises de estresse oxidativo, que incluíram a avaliação do perfil de despolarização mitocondrial, dosagem dos níveis de hidroperóxidos , determinação da capacidade antioxidante, dosagem dos metabólitos do óxido nítrico e avaliação dos perfis dos fatores de transcrição reguladores do balanço redox NRF2 e NFkB, realizados por marcação com tetrametilrodamina-etil-éster (TMRE), terc-butil hidroperóxido, parâmetro antioxidante total de captura de radicais (TRAP), diclorofluoresceína (DCF) e imunofluorescência, respectivamente. Observamos que o tratamento com TC em linhagens HeLa e SiHa de carcinoma cervical foi capaz de promover a redução da viabilidade celular, induzir alterações morfológicas e ultraestruturais com inibição da capacidade de migração do tecido nas duas linhagens. Posteriormente, descobrimos que o tratamento com TC foi capaz de promover despolarização mitocondrial, induzir a formação de gotículas lipídicas e vacúolos autofágicos com consequente morte celular por apoptose tardia. A TC também induziu a geração de estresse oxidativo observada pelo aumento da geração de hidroperóxidos na linhagem Hela e diminuição em SiHa. Houve ainda redução na produção dos metabólitos do NOx em ambos modelos avaliados. Concomitantemente, observamos superexpressão de NRF2 e diminuição da regulação do NF?B em células HeLa, enquanto na linhagem SiHa houve apenas estímulo de NF?B. Estes achados sugerem que a TC exerce seu efeito antiproliferativo no câncer cervical a partir da redução significativa da viabilidade das células HeLa e SiHa em todos os tempos testados (p=0,0001), indução de atividade citostática e geração de estresse oxidativo via distintos mecanismos de acordo com a origem e tecido acometido, tornando-se uma alternativa terapêutica promissora no desenvolvimento de compostos antitumorais frente ao carcinoma cervical.

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Navegando 01 - Doutorado - Fisiopatologia Clínica e Laboratorial por Autor "Amarante, Marla Karine"

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