Resposta oxidativa in vitro e in vivo do uso da metformina no tratamento do melanoma murino (B16F10)
| dataload.collectionmapped | 01 - Doutorado - Patologia Experimental | pt_BR |
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| dc.contributor.advisor | Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador] | pt_BR |
| dc.contributor.author | Sanches, Larissa Juliani | pt_BR |
| dc.contributor.banca | Fernandes, Glaura Scantamburlo Alves | pt_BR |
| dc.contributor.banca | Armani, André | pt_BR |
| dc.contributor.banca | Costa, Idessania Nazareth | pt_BR |
| dc.contributor.banca | Andrade, Fábio Goulart de | pt_BR |
| dc.contributor.coadvisor | Marinello, Poliana Camila [Coorientadora] | pt_BR |
| dc.coverage.spatial | Londrina | pt_BR |
| dc.date.accessioned | 2024-05-01T12:09:51Z | |
| dc.date.available | 2024-05-01T12:09:51Z | |
| dc.date.created | 2019.00 | pt_BR |
| dc.date.defesa | 22.03.2019 | pt_BR |
| dc.description.abstract | Resumo: O melanoma, tem origem nos melanócitos e sua incidência vem crescendo nas últimas décadas, resultado da interação de fatores de risco genéticos (como mutação em BRAF) e ambientais (como exposição à radiação UV, por exemplo) Quando diagnosticado precocemente, o tratamento mais indicado é a remoção cirúrgica, porém quando encontra-se metastizado para linfonodos ou órgãos distantes é comum ser refratário aos tratamentos, levando a uma baixa sobrevida O melanoma é resistente a grande parte dos tratamentos disponíveis até o presente momento e alguns processos estão associados a essa resistência A resistência intrínseca envolve a regulação positiva de receptores tirosina quinase e a reativação de MAPK, enquanto a resistência adquirida tardiamente está relacionada com mutações concorrentes em RAS ou MEK, amplificação da forma mutante de BRAF ou splicing alternativo O estresse oxidativo está intimamente relacionado aos processos de iniciação, proliferação e metástase do câncer bem como na resistência à terapia Estudos com a metformina tem mostrado que esta pode exercer uma ação na inibição do desenvolvimento do câncer A metformina é atualmente o medicamento mais prescrito mundialmente para o tratamento do diabetes tipo 2 No câncer a metformina atua nas vias de sinalização LKB1 – AMPK e mTOR A inibição do mTOR perturba a síntese de proteínas, ocasionando uma ação antineoplásica direta nas células tumorais, através da inibição da progressão do ciclo celular e indução da apoptose e autofagia Outros estudos, mostram que a metformina desencadeia a apoptose através da regulação negativa de Bcl-2, ativando Bax, p53, desencadeando apoptose através de sinalização da ERK, dependentes e independentes de caspases, inibindo o proto-oncogene c-MYC e HIF-1a via AMPK Com base nos efeitos promissores da metformina e na resistência do melanoma aos tratamentos disponíveis, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da metformina em células de melanoma murino metastático B16F1 em dois modelos experimentais: in vitro e in vivo No modelo in vitro, analisamos a participação da metformina no processo de indução de resistência à dacarbazina (DTIC) Para isso um fenótipo de resistência à DTIC foi induzido em células B16F1 A indução da resistência foi feita através da exposição das células a concentrações crescentes de DTIC As células foram plaqueadas em garrafas de 25cm2 na concentração de 1x16 e expostas a DTIC (1µg / mL, 1µg / mL, 25µg / mL, 5µg / mL, 75µg / mL, 1 µg / mL e 125 µg / mL) As células foram consideradas resistentes quando a exposição a DTIC não causava sua morte Para analisar a interferência da metformina no processo de indução de resistência, as células foram pré-tratadas com metformina (6 µM) durante 7 passagens e então foram induzidas à resistência a DTIC, grupo denominado MET-DTIC As células foram coletadas em todas as passagens, para a análise de marcadores de estresse oxidativo 8-OH-DG, p53, Nrf2 e NF-kB Os resultados revelam que o fenótipo de resistência a DTIC nas células B16F1 foi induzido com o protocolo experimental utilizado e que a metformina é capaz de atenuar este processo de indução de resistência Além de prevenir a indução de resistência a metformina atua aumentando os níveis de antioxidantes celulares e modula vias de sinalização importantes para a quimiorresistência, aumentando a marcação nuclear de p53 e reduzindo a marcação nuclear de NF?B e Nrf2 Na avaliação do efeito da metformina no melanoma in vivo, dois objetivos distintos foram trabalhados: primeiramente foi avaliado o efeito da metformina no tratamento do melanoma metastático, bem como sua ação em conjunto com o quimioterápico DTIC, em um segundo momento, avaliamos a ação da metformina na implantação das células tumorais no pulmão Para responder o primeiro objetivo, os animais foram inoculados com células B16F1 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo (C+), onde os animais não foram tratados; grupo Metformina (MET), tratado com metformina na concentração de 2mg ip do 1o ao 14o dia; Grupo Dacarbazina (DTIC), tratado com dacarbazina concentração de 5mg/kg ip do 5º ao 1º dia; grupo Metformina + Dacarbazina (MET-DTIC), tratado com metformina e dacarbazina nas mesmas condições mencionadas acima; e grupo controle negativo (C-), em que os animais foram inoculados com meio de cultura (DMEM) sem soro e não receberam tratamento Para o segundo objetivo, todos os animais foram tratados com metformina na concentração de 2mg ip durante 5 dias, após esse período os animais foram inoculados com células B16F1 4x16 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo PTM (C+), PTM (MET), PTM (DTIC) e PTM (MET-DTIC), seguindo os mesmos protocolos de tratamento descritos para o primeiro objetivo Nos dois protocolos experimentais, os animais foram pesados durante todo o tempo experimental e o consumo de ração por animal em cada grupo foi calculado Após os 14 dias de experimento, os animais foram eutanásiados e foi realizada a punção cardiaca para a análise sistêmica e a retirada cuidadosa dos pulmões Foram realizadas as contagens de nódulos metástaticos em todos os pulmões Foram realizadas análises de estresse oxidativo no microambiente tumoral e sistêmico A arquitetura pulmonar e marcadores de vias de sinalização envolvidas com proliferação, estresse oxidativo e morte celular também foram analisados devido à sua relação com a resistência aos tratamentos disponíveis Os resultados demonstram que a metformina tem um importante papel na modulação de importantes vias de sinalização, como a p53, PCNA e Nrf2, interferindo assim no estresse oxidativo e culminando em uma ação antitumoral e antimetastática Diminuindo assim o número de nódulos metastáticos quando utilizada isoladamente e potencializando o efeito da DTIC, além de diminuir os efeitos colaterais do quimioterápico Dessa forma pode-se concluir que a metformina tem um potencial terapêutico por apresentar atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo de melanoma murino, estudados com as células B16F1 Essa atividade é acompanhada pela modulação de vias importantes para a viabilidade de células tumorais como, estresse oxidativo, crescimento e morte celular resposáveis, em parte, pela resistência do melanoma a quimioterápicos atualmente disponíveis | pt_BR |
| dc.description.abstractother1 | Abstract: Melanoma originates in melanocytes and its incidence has been increasing in recent decades, as a result of the interaction of genetic risk factors (such as BRAF mutation) and environmental risk factors (such as exposure to UV radiation, for example) When it is diagnosed early, the most indicated treatment is surgical removal, but when metastasized to lymph nodes or distant organs, it is common to be refractory to the treatments, leading to a low survival rate Melanoma is resistant to most treatments available to date and some processes are associated with this resistance Intrinsic resistance involves positive regulation of tyrosine kinase receptors and reactivation of MAPK, whereas late acquired resistance is related to concurrent mutations in RAS or MEK, amplification of the mutant form of BRAF or alternative splicing Oxidative stress is closely related to the processes of initiation, proliferation and metastasis of cancer as well as resistance to therapy Studies with metformin have shown that it may exert an action in inhibiting the development of cancer Metformin is currently the world's most widely prescribed drug for the treatment of type 2 diabetes In cancer metformin acts on the LKB1-AMPK and mTOR signaling pathways Inhibition of mTOR disrupts protein synthesis, leading to direct antineoplastic action in tumor cells, by inhibiting cell cycle progression and induction of apoptosis and autophagy Other studies show that metformin triggers apoptosis through downregulation of Bcl-2, activating Bax, p53, triggering apoptosis through ERK signaling, dependent and independent of caspases, inhibiting the proto-oncogene c-MYC and HIF-1a via AMPK Based on the promising effects of metformin and melanoma resistance to available treatments, the present study aimed to study the effects of metformin on B16F1 metastatic murine melanoma cells in two experimental models: in vitro and in vivo In the in vitro model, we analyzed the participation of metformin in the induction of resistance to dacarbazine (DTIC) For this a phenotype of resistance to DTIC was induced in B16F1 cells Induction of resistance was done by exposing the cells to increasing concentrations of DTIC The cells were plated in 1x16 25cm2 bottles and exposed to DTIC (1µg / mL, 1µg / mL, 25µg / mL, 5µg / mL, 75µg / mL, 1µg / mL and 125µg / mL) Cells were considered resistant when exposure to DTIC did not cause their death To analyze the interference of metformin in the resistance induction process, the cells were pretreated with metformin (6 µM) for 7 passages and then were induced to resistance to DTIC, a group termed MET-DTIC Cells were collected at all passages for the analysis of 8-OH-DG, p53, Nrf2 and NF-kB oxidative stress markers The results show that the phenotype of DTIC resistance in B16F1 cells was induced with the experimental protocol used and that metformin is able to attenuate this induction of resistance process In addition to preventing the induction of resistance, metformin acts by increasing cellular antioxidant levels and modulates signaling pathways important for chemoresistance, increasing p53 nuclear labeling and reducing nuclear labeling of NF?B and Nrf2 In the evaluation of the effect of metformin on melanoma in vivo, two different objectives were worked out: first, the effect of metformin in the treatment of metastatic melanoma was evaluated, as well as its action together with the DTIC chemotherapy, in a second moment, we evaluated the action of metformin in the implantation of tumor cells in the lung To respond to the first objective, the animals were inoculated with B16F1 cells by the ophthalmic plexus, and divided into the groups: positive control (C +), where the animals were not treated; Metformin group (MET) treated with metformin at the concentration of 2mg ip from the 1st to the 14th day; Dacarbazine group (DTIC), treated with dacarbazine concentration of 5mg / kg ip from the 5th to the 1th day; Metformin + Dacarbazine (MET-DTIC) group, treated with metformin and dacarbazine under the same conditions as mentioned above; and negative control group (C-), in which the animals were inoculated with serum-free culture medium (DMEM) and received no treatment For the second objective, all animals were treated with metformin at the concentration of 2mg ip for 5 days, after that period the animals were inoculated with 4x16 B16F1 cells by the ophthalmic plexus and divided into the groups: positive control PTM (C +), PTM (MET), PTM (DTIC) and PTM (MET-DTIC) Same treatment protocols described for the first objective In both experimental protocols, the animals were weighed throughout the experimental time and the feed intake per animal in each group was calculated After 14 days of experiment, the animals were euthanized and cardiac puncture was performed for systemic analysis and careful removal of the lungs Metastasis nodule counts were performed in all lungs Oxidative stress analyzes were performed in the tumor and systemic microenvironment Pulmonary architecture and markers of signaling pathways involved with proliferation, oxidative stress and cell death were also analyzed because of their relationship to resistance to available treatments The results demonstrate that metformin plays an important role in modulating important signaling pathways, such as p53, PCNA and Nrf2, thus interfering with oxidative stress and culminating in antitumor and antimetastatic action This decreases the number of metastatic nodules when used alone and potentiates the effect of DTIC, in addition to decreasing the side effects of chemotherapy In this way it can be concluded that metformin has a therapeutic potential for having antitumor activity in in vitro and in vivo models of murine melanoma, studied with B16F1 cells This activity is accompanied by the modulation of pathways important for the viability of tumor cells such as oxidative stress, growth and cell death, which are partly due to the resistance of melanoma to currently available chemotherapeutic agents | pt_BR |
| dc.description.notes | Tese (Doutorado em Patologia Experimental) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental | pt_BR |
| dc.identifier.uri | https://repositorio.uel.br/handle/123456789/9701 | |
| dc.language | por | |
| dc.relation.coursedegree | Doutorado | pt_BR |
| dc.relation.coursename | Patologia Experimental | pt_BR |
| dc.relation.departament | Centro de Ciências Biológicas | pt_BR |
| dc.relation.ppgname | Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental | pt_BR |
| dc.subject | Patologia experimental | pt_BR |
| dc.subject | Melanoma | pt_BR |
| dc.subject | Estresse oxidativo | pt_BR |
| dc.subject | Metformina | pt_BR |
| dc.subject | Experimental pathology | pt_BR |
| dc.subject | Melanoma | pt_BR |
| dc.subject | Oxidative stress | pt_BR |
| dc.subject | Metformin | pt_BR |
| dc.title | Resposta oxidativa in vitro e in vivo do uso da metformina no tratamento do melanoma murino (B16F10) | pt_BR |
| dc.type | Tese | pt_BR |
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