Associação da plumbagina e doxorrubicina na modulação de mRNA em cultura 2D e 3D e na alteração de parâmetros relacionados a morte por ferroptose e piroptose em células HepG2/C3A

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dc.contributor.advisorMantovani, Mário Sérgio
dc.contributor.authorOliveira, Liana Martins de
dc.contributor.bancaLepri, Sandra Regina
dc.contributor.bancaBidóia, Danielle Lazarin
dc.coverage.extent98 p.
dc.coverage.spatialLondrina - PR
dc.date.accessioned2025-10-31T13:43:58Z
dc.date.available2025-10-31T13:43:58Z
dc.date.issued2024-07-25
dc.description.abstractA doxorrubicina é um agente quimioterápico utilizado no tratamento do câncer. Contudo, a eficácia do tratamento pode ser comprometida quando o tumor apresenta resistência à droga. Os efeitos adversos resultantes da toxicidade relacionada às altas dosagens e a resistência celular à droga podem ser mitigados mediante a combinação de bioativos em concentrações menos citotóxicas. A plumbagina é um fitoquímico extraído de plantas do gênero Plumbago, que exibe atividades biológicas, como efeitos antioxidante, antibacteriano, antifúngico, anti-inflamatório e antitumoral. Nesse contexto, a associação dessas moléculas foi testada para a avaliação dos efeitos celulares no aspecto morfológico e molecular em células de hepatocarcinoma humano (HepG2/C3A) em modelos 2D e 3D. Para isso, realizou-se teste de citotoxicidade com resazurina e ensaio clonogênico, monitoramento celular por time-lapse, avaliação de danos no DNA (ensaio do cometa), marcação de gotículas lipídicas intracelulares, monitoramento de volume esferoidal, coloração fluorescente de esferoides com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio e RT-qPCR para genes das vias de morte celular (CASP3, CASP8, CASP9, PARP1, BBC3, BIRC5, BCL2 e TNF), autofagia (BECN1 e SQSTM1), ciclo celular (C-MYC, NF-kB, CDKN1A, M-TOR e TRAF2), reparo de danos no DNA (H2AFX, GADD45A e GADD45AG), estresse oxidativo (GPX1), estresse no retículo endoplasmático (EIF2AK3 e ERN1), metabolismo de xenobióticos (CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4, CYP2E1, CYP2C9) e marcadores de ferroptose e piroptose (NQO1, NRF2, SLC7A11, ASNS, HMOX1, CHAC1, ACSL4, NFE2L2, TRFC, GSDMD) nos modelos experimentais 2D e 3D. Fez-se a análise estatística no software GraphPad Prism 9.4, de acordo com a normalidade e disposição dos dados. As associações reduziram significativamente a proliferação celular em relação aos seus isolados, apresentando efeito aditivo e sinérgico. Foi observado que as associações aceleram o processo de morte e, os tipos de processos morfológicos de morte são influenciados pela concentração, sendo, portanto, diferentes nas diferentes concentrações avaliadas. As associações apresentaram capacidade de redução da sobrevida celular, além disso, observou-se também que essas associações são genotóxicas. A doxorrubicina, a menor concentração de plumbagina e a menor concentração de associação testada apresentaram marcação mais intensa para corpúsculos lipídicos. As associações reduzem o crescimento esferoidal e alteraram o padrão de coloração por Hoechst 33342 (núcleo) e Iodeto de Propídio (morte). As associações alteraram a expressão de mRNAs de vias moleculares envolvidas no processo de morte, regulação do ciclo celular, reparo de dano do DNA e metabolismo de xenobióticos. Os processos de morte observados nas células expostas às associações, bem como os padrões moleculares alterados, evidenciam processo de ferroptose (menor concentração) e piroptose (evidenciada na maior concentração). Esses resultados demonstram que as associações de plumbagina e baixa concentração da doxorrubicina (IC25) apresentam atividade antiproliferativa, atuando por meio do impedimento da formação de colônias, causando alterações no DNA e na expressão de mRNAs de vias de processo de morte, regulação do ciclo celular, reparo de dano do DNA e metabolismo de xenobióticos, contribuindo para o entendimento e desenvolvimento de novos protocolos para um possível tratamento com esses compostos no câncer.
dc.description.abstractother1Doxorubicin is a chemotherapy agent used to treat cancer. However, the effectiveness of treatment may be compromised when the tumor is resistant to the drug. Adverse effects resulting from toxicity related to high doses and cellular resistance to the drug can be mitigated by combining bioactives in less cytotoxic concentrations. Plumbagin is a phytochemical extracted from plants of the Plumbago genus, which exhibits biological activities, such as antioxidant, antibacterial, antifungal, anti-inflammatory, and antitumor effects. In this context, the association of these molecules was tested to evaluate cellular effects in the morphological and molecular aspects of human hepatocellular carcinoma cells (HepG2/C3A) in 2D and 3D models. To this end, a cytotoxicity test was carried out with resazurin and a clonogenic assay, time-lapse cell monitoring, DNA damage assessment (comet assay), intracellular lipid droplet labeling, spheroidal volume monitoring, fluorescent staining of spheroids with Hoechst 33342 and Propidium Iodide and RT-qPCR for genes from the cell death pathways (CASP3, CASP8, CASP9, PARP1, BBC3, BIRC5, BCL2 and TNF), autophagy (BECN1 and SQSTM1), cell cycle (C-MYC, NF- kB, CDKN1A, M-TOR and TRAF2), DNA damage repair (H2AFX, GADD45A, and GADD45AG), oxidative stress (GPX1), endoplasmic reticulum stress (EIF2AK3 and ERN1), xenobiotic metabolism (CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4, CYP2E1, CYP2C9) and markers of ferroptosis and pyroptosis (NQO1, NRF2, SLC7A11, ASNS, HMOX1, CHAC1, ACSL4, NFE2L2, TRFC, GSDMD) in 2D and 3D experimental models. Statistical analysis was carried out using the GraphPad Prism 9.4 software, according to the normality and arrangement of the data The associations significantly reduced cell proliferation in relation to their isolates, presenting an additive and synergistic effect. It was observed that the associations accelerate the death process and the types of morphological death processes are influenced by the concentration, and are therefore different in the different concentrations evaluated. The associations showed the capacity to reduce cell survival, in addition, it was also observed that these associations are genotoxic. Doxorubicin, the lowest concentration of plumbagin and the lowest concentration of the combination tested showed more intense staining for lipid bodies. The associations reduce spheroidal growth and altered the staining pattern by Hoechst 33342 (nucleus) and Propidium Iodide (death). The associations altered the expression of mRNAs of molecular pathways involved in the death process, cell cycle regulation, DNA damage repair and xenobiotic metabolism. The death processes observed in cells exposed to the associations, as well as the altered molecular patterns, demonstrate the process of ferroptosis (lower concentration) and pyroptosis (evidenced at higher concentrations). These results demonstrate that the combinations of plumbagin and low concentration of doxorubicin (IC25) present antiproliferative activity, acting by preventing the formation of colonies, causing changes in DNA and in the expression of mRNAs of death process pathways, regulation of the cell cycle , DNA damage repair and xenobiotic metabolism, contributing to the understanding and development of new protocols for possible treatment with these compounds in cancer.
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/18976
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCB - Departamento de Biologia Geral
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular
dc.subjectSinergismo
dc.subjectToxicidade
dc.subjectEsferoide
dc.subjectRT-qPCR
dc.subjectExpressão Gênica
dc.subjectDoxorrubicina
dc.subjectCâncer
dc.subjectQuimioterapia combinada
dc.subjectCitotoxicidade
dc.subjectPiroptose
dc.subjectReparo de DNA
dc.subjectCiclo celular
dc.subject.capesCiências Biológicas - Biologia Geral
dc.subject.cnpqCiências Biológicas - Biologia Geral
dc.subject.keywordsSynergy
dc.subject.keywordsToxicity
dc.subject.keywordsSpheroid
dc.subject.keywordsRT-qPCR
dc.subject.keywordsGene Expression
dc.subject.keywordsDoxorubicin
dc.subject.keywordsCancer
dc.subject.keywordsCombination chemotherapy
dc.subject.keywordsCytotoxicity
dc.subject.keywordsPyroptosis
dc.subject.keywordsDNA repair
dc.subject.keywordsCell cycle
dc.titleAssociação da plumbagina e doxorrubicina na modulação de mRNA em cultura 2D e 3D e na alteração de parâmetros relacionados a morte por ferroptose e piroptose em células HepG2/C3A
dc.title.alternativeAssociation of plumbagin and doxorubicin in the modulation of mRNA in 2D and 3D culture and in the change of parameters related to death by ferroptosis and pyroptosis in HepG2/C3A cells
dc.typeDissertação
dcterms.educationLevelMestrado Acadêmico
dcterms.provenanceCentro de Ciências Biológicas

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