Tioidantoínas e hidantoínas como inibidores de urease microbiana: estudo de interações receptor-ligante por ressonância magnética nuclear

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dc.contributor.advisorMacedo Júnior, Fernando César de
dc.contributor.authorCarlo, Danilo Henrique
dc.contributor.bancaRezende, Maria Inês
dc.contributor.bancaFernandes, Sérgio Antonio
dc.coverage.extent86 p.
dc.coverage.spatialLondrina
dc.date.accessioned2024-11-26T14:06:43Z
dc.date.available2024-11-26T14:06:43Z
dc.date.issued2024-07-31
dc.description.abstractUreases são metaloenzimas da classe das hidrolases que possuem um sítio ativo binuclear de Ni(II). Sua função é a catálise da reação de hidrólise da ureia, a qual apresenta implicações importantes em diferentes contextos. No âmbito medicinal, a enzima produzida por microrganismos patogênicos, de origem bacteriana ou fúngica, pode contribuir para a sua sobrevivência e proliferação no tecido infectado, e para o aumento da sua virulência. Por isso, o desenvolvimento de inibidores de urease, e o entendimento dos seus modos de ação são de grande relevância. Neste trabalho, Tioidantoínas e Hidantoínas relatadas como inibidores da urease vegetal de Canavalia ensiformis são estudadas como inibidores da urease microbiana presente em lisados de culturas do fungo Cryptococcus neoformans. Os resultados de inibição contra a atividade ureolítica presente nestes lisados diferiram do modelo vegetal em vários quesitos: os enantiômeros derivados da L-Valina (1) e D-Valina (2) foram ativos com a mesma porcentagem de inibição (86%), ao passo que os valores relatados frente à urease vegetal são de 90 e 27%, respectivamente; a Hidantoína derivada da L-metionina (3) foi determinada como um fraco inibidor da urease fúngica (14,9%), contrastando com seu alto desempenho contra a vegetal (86%); a inibição da Tioidantoína derivada da L-metionina (4, análoga de 3) com valores similares aos de 1 e 2 (84%), reforça a importância do grupo tiocarbonila para a interação com a enzima. Ensaios de RMN por Diferença de Transferência de Saturação (STD) foram realizados com o lisado bruto a fim de determinar parâmetros de interação intermolecular e cinética de inibição. Os desafios desta abordagem, sobretudo devido à presença de glicerol nos lisados celulares, foram em grande parte superados através de diálise e liofilização. Assim, com mínima manipulação do lisado bruto, obtiveram-se soluções ureolíticas aquosas livres de interferentes de baixo peso molecular. Esses progressos geraram um aumento de 33 vezes na razão sinal/ruído dos espectros de STD, viabilizando a identificação dos sítios dos inibidores envolvidos intimamente com a ligação com a enzima (mapeamento de epítopos). As porcentagens de efeito STD do ligante 1, de 100 e 95% para os grupos metila diastereotópicos da cadeia lateral isopropílica, indicaram ausência de estereoespecificidade para a interação. Os ensaios de RMN de Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE), utilizados pela primeira vez para urease, foram valiosos para o estudo de interação entre urease fúngica e ligante 1. O efeito paramagnético exercido pelo sítio ativo bimetálico de Ni(II) da enzima sobre o solvente elevou a velocidade de relaxação longitudinal (R1) da água em 0,3 s-1. A adição do inibidor 1 em concentrações de 1,0 a 3,0 mM reduziu R1 sucessivamente, restaurando o valor inicial no último ponto de titulação, caracterizando assim a afinidade do ligante pelo sítio ativo. De forma geral, este trabalho demonstra a eficácia da RMN para o estudo de interações de inibidores e ureases microbianas em lisados proteicos de maneira seletiva e confiável.
dc.description.abstractother1Ureases are metalloenzymes from the class of hydrolases which bear a Ni(II) binuclear active site. Their function is the catalysis of the urea hydrolysis reaction, which presents important implications in different contexts. In the medicinal scope, the enzyme produced by pathogenic microorganisms, from either bacterial or fungal origin, may contribute to their survival and proliferation on the infected tissue, and to the increase in their virulence. Therefore, the development of urease inhibitors, as well as the understanding of their action modes are of crucial relevance. In the present work, Thiohydantoins and Hydantoins reported as inhibitors of the vegetal urease of Canavalia ensiformis are studied as inhibitors of the microbial urease present in lyse cultures of the fungus Cryptococcus neoformans. The results of inhibition against the ureolytic activity present on these lysates diverged from the vegetal model in several aspects: the enantiomers derived from L-Valine (1) and D-Valine (2) were active with the same inhibition percentage (86%), whereas the reported values concerning the vegetal urease are of 90 and 27%, respectively; the Hydantoin derived from L-methionine (3) was determined as a weak inhibitor of the fungal urease (14,9%), contrasting from its high performance observed against the vegetal urease (86%); the inhibition of the Thiohydantoin derived from L-methionine (4, analogous to 3) with similar values to those of 1 and 2 (84%), reinforces the importance of the thiocarbonyl group for the enzyme interaction. NMR assays by Saturation Transfer Difference (STD) were applied on the crude lysate with the aim of determining intermolecular interaction and inhibition kinetics parameters. The challenges for this approach, mainly due to the presence of glycerol on the cell lysates, were in great part overcome through dialysis and lyophilization. Thus, with minimal manipulation of the crude lysate, ureolytic aqueous solutions free from low molecular weight interferents were obtained. These progresses generated a 33-fold increase on the signal to noise ratio of the STD spectra, rendering viable the identification of the inhibitor sites intimately involved with the enziyme binding (epitope mapping). The STD effect percentages of ligand 1, of 100 and 95% for the diastereotopic methyl groups from the isopropyl side chain, were indicative of the absence of stereospecificity for the interaction. The NMR assays of Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE), employed for the very first time for urease, were valuable for the study of interaction between fungal urease and ligand 1. The paramagnetic effect exerted by the enzyme’s bimetallic Ni(II) active site over the solvent lead to an enhancement of water longitudinal relaxation rate (R1) by 0.3 s-1. The addition of 1 at concentrations ranging from 1,0 to 3,0 mM successively reduced R1, restoring the initial value at the last titration point, and thus characterizing the ligand affinity towards the active site. In a general way, this work shows the efficacy of NMR for the study of interactions between inhibitors and microbial ureases on protein lysates in a selective and reliable protocol.
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/18481
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCE - Departamento de Química
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Química
dc.subjectUrease
dc.subjectCryptococcus neoformans
dc.subjectTioidantoínas
dc.subjectHidantoínas
dc.subjectInibidores
dc.subjectEnzimas
dc.subjectHidrólise
dc.subjectUréia
dc.subject.capesCiências Exatas e da Terra - Química
dc.subject.cnpqCiências Exatas e da Terra - Química
dc.subject.keywordsUrease
dc.subject.keywordsCryptococcus neoformans
dc.subject.keywordsThiohydantoins
dc.subject.keywordsHydantoins
dc.subject.keywordsInhibitors
dc.subject.keywordsEnzymes
dc.subject.keywordsHydrolysis
dc.subject.keywordsUrea
dc.titleTioidantoínas e hidantoínas como inibidores de urease microbiana: estudo de interações receptor-ligante por ressonância magnética nuclear
dc.title.alternativeTiohydantoins and hydantoins as inhibitors of microbial urease: study of receptor-ligand interactions by muclear magnetic resonance
dc.typeDissertação
dcterms.educationLevelMestrado Acadêmico
dcterms.provenanceCentro de Ciências Exatas

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