Tioidantoínas e hidantoínas como inibidores de urease microbiana: estudo de interações receptor-ligante por ressonância magnética nuclear
Data
2024-07-31
Autores
Carlo, Danilo Henrique
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Resumo
Ureases são metaloenzimas da classe das hidrolases que possuem um sítio ativo binuclear de Ni(II). Sua função é a catálise da reação de hidrólise da ureia, a qual apresenta implicações importantes em diferentes contextos. No âmbito medicinal, a enzima produzida por microrganismos patogênicos, de origem bacteriana ou fúngica, pode contribuir para a sua sobrevivência e proliferação no tecido infectado, e para o aumento da sua virulência. Por isso, o desenvolvimento de inibidores de urease, e o entendimento dos seus modos de ação são de grande relevância. Neste trabalho, Tioidantoínas e Hidantoínas relatadas como inibidores da urease vegetal de Canavalia ensiformis são estudadas como inibidores da urease microbiana presente em lisados de culturas do fungo Cryptococcus neoformans. Os resultados de inibição contra a atividade ureolítica presente nestes lisados diferiram do modelo vegetal em vários quesitos: os enantiômeros derivados da L-Valina (1) e D-Valina (2) foram ativos com a mesma porcentagem de inibição (86%), ao passo que os valores relatados frente à urease vegetal são de 90 e 27%, respectivamente; a Hidantoína derivada da L-metionina (3) foi determinada como um fraco inibidor da urease fúngica (14,9%), contrastando com seu alto desempenho contra a vegetal (86%); a inibição da Tioidantoína derivada da L-metionina (4, análoga de 3) com valores similares aos de 1 e 2 (84%), reforça a importância do grupo tiocarbonila para a interação com a enzima. Ensaios de RMN por Diferença de Transferência de Saturação (STD) foram realizados com o lisado bruto a fim de determinar parâmetros de interação intermolecular e cinética de inibição. Os desafios desta abordagem, sobretudo devido à presença de glicerol nos lisados celulares, foram em grande parte superados através de diálise e liofilização. Assim, com mínima manipulação do lisado bruto, obtiveram-se soluções ureolíticas aquosas livres de interferentes de baixo peso molecular. Esses progressos geraram um aumento de 33 vezes na razão sinal/ruído dos espectros de STD, viabilizando a identificação dos sítios dos inibidores envolvidos intimamente com a ligação com a enzima (mapeamento de epítopos). As porcentagens de efeito STD do ligante 1, de 100 e 95% para os grupos metila diastereotópicos da cadeia lateral isopropílica, indicaram ausência de estereoespecificidade para a interação. Os ensaios de RMN de Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE), utilizados pela primeira vez para urease, foram valiosos para o estudo de interação entre urease fúngica e ligante 1. O efeito paramagnético exercido pelo sítio ativo bimetálico de Ni(II) da enzima sobre o solvente elevou a velocidade de relaxação longitudinal (R1) da água em 0,3 s-1. A adição do inibidor 1 em concentrações de 1,0 a 3,0 mM reduziu R1 sucessivamente, restaurando o valor inicial no último ponto de titulação, caracterizando assim a afinidade do ligante pelo sítio ativo. De forma geral, este trabalho demonstra a eficácia da RMN para o estudo de interações de inibidores e ureases microbianas em lisados proteicos de maneira seletiva e confiável.
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Palavras-chave
Urease, Cryptococcus neoformans, Tioidantoínas, Hidantoínas, Inibidores, Enzimas, Hidrólise, Uréia