Análise da expressão de genes que codificam enzimas antioxidantes em citrumeleiro 'Swingle' com alto acúmulo de prolina submetido ao déficit hídrico
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Resumo: Condições de estresse abiótico levam ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio com o concomitante aumento da atividade de enzimas antioxidantes em plantas Estudos anteriores mostraram que aplicações exógenas de prolina amenizam os efeitos deletérios causados pelo estresse oxidativo devido à sua habilidade de aumentar a atividade de enzimas antioxidantes Entretanto, não existem relatos dos efeitos da acumulação endógena de prolina na expressão de genes que codificam enzimas antioxidantes em condições normais de suprimento de água e em resposta ao déficit hídrico O objetivo deste trabalho foi analisar a expressão relativa de transcritos de genes de quatro enzimas antioxidantes (Ascorbato peroxidase - APX, Catalase - CAT, Superóxido dismutase - SOD e Glutationa redutase - GR) em plantas transgênicas de citrumeleiro Swingle com alto acúmulo de prolina submetido ao déficit hídrico Primeiramente, para a identificação dos genes apropriados para utilizar como controle interno em tratamentos experimentais em condições de estresse hídrico por PCR em Tempo Real foi analisada a expressão de sete genes housekeeping funcionalmente distintos (ciclofilina - CYP, catepsina - CtP, actina - ACT, glucose-6-fosfato dehidrogenase - GAPDH, fator de alongamento 1a - EF1a, ß-tubulina - ß-TUB e ADP- fator de ribosilação – ADP) A estabilidade de expressão destes genes foi calculada através do software geNorm, a partir do qual foi verificado que o gene EF1a é o mais adequado A partir do banco de dados HarvEST Citrus foram obtidas sequencias de isoformas altamente expressas dos genes APX (ascorbato peroxidases APX1 e APX2 citosólicas e APXCL de cloroplasto), CAT (catalases CAT1 e CAT2), GR (glutationa redutases citosólica e GRCL de cloroplasto) e SOD (superóxido dismutases Cu/ZnSOD1 e Cu/ZnSOD2 citosólicas, Cu/ZnSODCL de cloroplasto, MnSOD mitocondrial e FeSOD cloroplasto) Plantas controle não transformadas e transgênicas com o gene mutante P5CSF129A foram submetidas à deficiência hídrica até atingirem a condição de estresse severo, e posteriormente recuperadas A coleta de folhas foi baseada em valores semelhantes de potencial total de água: condições normais de suprimento de água (?t = -1,3 MPa), estresse moderado (?t= -2,3 a -2,5 MPa), estresse severo (?t= -3,8 a -3,9 MPa) e recuperado (24h após irrigação; ?t= -1,3 a -1,9 MPa) A alta quantidade de prolina presente em plantas de citrumeleiro Swingle expressando o gene P5CSF129A induziu maior atividade transcricional da maioria da isoformas analisadas em condições normais de suprimento de água Nesta condição, as isoformas cujo aumento de expressão foi mais significativo foram as APX1, APXCL, CuZnSOD2 e CAT2 Durante o período de déficit hídrico a prolina apresentou maior influência sobre a expressão das isoformas APX1, APX2, APXCL, MnSOD e GRCL, com a elevação nos níveis de transcritos Já durante a recuperação do estresse, as isoformas cuja expressão foi aumentada em plantas transgênicas foram APX1, CAT1, CuZnSODCL e GRCL Estes dados demonstram que o alto acúmulo de prolina em plantas transgênicas de citrumeleiro Swingle alterou a transcrição de genes de enzimas antioxidantes tanto em condições normais de suprimento de água como sob déficit hídrico Os efeitos da prolina na atividade de enzimas antioxidantes, como APX, CAT e SOD já foram objeto de vários estudos, porém são escassos os trabalhos que mostram a influência da alta concentração intracelular deste aminoácido na expressão dos genes que codificam estas enzimas Os resultados aqui relatados também fornecem informações inéditas para o entendimento da regulação de processos biológicos em resposta a estresses abióticos, mostrando que a prolina pode atuar como uma molécula regulatória/sinalizadora capaz de alterar a expressão de genes envolvidos nas respostas das plantas a condições de déficit hídrico
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Palavras-chave
Biotecnologia vegetal, Enzimas, Genética, Genética vegetal, Expressão, Crop biotechnology, Enzymes, Plant genetics, Expression, Genes