Identificação de genes associados a produção de ocratoxina A em Aspergillus westerdijkiae
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Sartori, Daniele
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Resumo
Resumo: Micotoxinas, metabólitos secundários de fungos, são compostos tóxicos encontrados em uma grande variedade de alimentos que, quando ingeridos, podem colocar em risco a saúde humana e animal Dentre as diversas micotoxinas, especial interesse tem sido dado à ocratoxina A (OA), produzida por algumas espécies de Aspergillus e Penicillium Esta micotoxina é encontrada com frequência principalmente em alimentos como grãos e uvas e, quando ingerida e acumulada, pode causar efeitos como, nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, imunossupressão e carcinogenicidade Ocratoxinas são formadas a partir de pentacetídeos cíclicos, derivados de dihidroisocumarina e ligados a L-fenilalanina, entretanto, informações sobre a síntese e a regulação da OA ainda são limitadas Este trabalho teve por objetivo identificar genes e proteínas com expressão diferencial entre linhagens produtoras e não produtoras de OA, com auxílio das técnicas de Análise da Expressão Diferencial (RDA), Análise Proteômica, e PCR em Tempo Real Inicialmente, foram obtidos fragmentos gênicos (aproximadamente 4 pb) diferencialmente expressos entre a linhagem produtora (UEL91) e não produtora (ITAL163) de OA, cultivadas em meio permissivo (YES) Aproximadamente 26 transcritos foram obtidos, dos quais três oxidases denominadas de P45-AL, P45-PH e OXI-1 foram de especial interesse As oxidases P45-AL e OXI-1 apresentaram maior expressão diferencial (32 e 2 vezes, respectivamente), o que foi confirmado por PCR em Tempo Real Por isso, genes codificadores destas duas oxidases foram avaliados quanto à associação entre a quantidade de OA e de transcritos expressos em meio de cultura permissivo (YES), semi-permissivo (CY) e restritivo (EM) à produção de OA Foi encontrada associação entre o nível de transcritos e a presença de OA para ambos os genes, embora em diferentes magnitudes Em um segundo estudo, foi usado uma linhagem mutante de Aspergillus westerdijkiae (ITAL142-T1) com reduzida produção de OA Este mutante possui um gene interrompido pela integração de um T-DNA, similar ao loco An9g58 de Aspergillus niger, que codifica um possível fator de transcrição PHD (Rum1), envolvido em eventos regulatórios mediados pela cromatina A linhagem mutante (ITAL142-T1) foi usada para a análise proteômica diferencial com a linhagem selvagem (ITAL142), em meio permissivo à produção de OA, com o objetivo de identificar proteínas que estão sob a regulação do fator de transcrição PHD Dentre 23 proteínas identificadas com maior expressão na linhagem selvagem, a maior frequência foi de proteínas de resposta a stress (36,4%) e da subunidade regulatória 26S do proteassoma (9,1%) Devido a ser usual o compartilhamento de genes regulatórios da biossíntese de micotoxinas e do processo de esporulação em fungos, foi feito uma análise dos conídios (produção e características morfológicas) de ITAL142 e ITAL142-T1 nos meios MEA e YES Nenhuma alteração quanto à conidiação foi observada em MEA, no entanto, em YES, houve a formação de maior número de conídios Em seguida, a quantidade de transcritos relacionados às proteínas 14-3-3 e à subunidade regulatória 26S do proteassoma foi analisada via PCR em Tempo Real Para ambos, foi detectada expressão relativa maior em ITAL142 comparativamente à de ITAL142-T1, confirmando os dados de expressão diferencial observada pela análise proteômica Em síntese, os dois estudos permitiram identificar genes associados à produção de OA
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Palavras-chave
Genética microbiana, Aspergillus, Ocratoxinas, Microbiologia, Microbial genetics, Ochratoxins