Quitinases de Beauveria bassiana : produção e polimorfismo genético
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Sassá, Danieli Cristina
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Resumo
Resumo: Os fungos apresentam uma vantagem com relação a outros entomopatógenos, pois não precisam ser ingeridos para causar a infecção, penetrando o exoesqueleto do inseto por meio da ação de enzimas hidrolíticas como proteases e quitinases Beauveria bassiana é um entomopatógeno amplamente estudado devido a sua capacidade de infectar e matar várias espécies de insetos A produção de quitinases pode ser influenciada pela constituição da cutícula do hospedeiro e polimorfismos do gene codificador desta enzima pode ser uma das causas de alterações na capacidade de infecção do fungo Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o tempo de produção, propriedades cinéticas e purificação de quitinases de B bassiana em meios de cultivo com e sem substratos indutores derivados de insetos; e verificar a existência de polimorfismos no gene da quitinase que possam estar relacionados com a atividade enzimática e mortalidade causada sobre a broca-do-café (Hypothenemus hampei) Para avaliar a produção e atividade de quitinases, a cepa CG432 foi cultivada em meio liquido contendo 1% de glucose ou adicionado de 1% de adultos mortos triturados de Zabrotes subfasciatus ou exúvias trituradas de larvas de Tenebrio molitor como substratos indutores, e inoculadas a 1% com uma suspensão 18 conídios/mL, a 28ºC a 15rpm A verificação da ocorrência de polimorfismos no gene da quitinase foi realizada por meio da técnica de PCR-RFLP em 3 cepas de B bassiana isoladas de diferentes espécies de insetos e várias origens geográficas cultivadas em meio de cultivo líquido contendo 1% de glucose como fonte de carbono As quitinases produzidas em meio contendo somente glucose demonstraram atividade ótima em pH ácido de 5,5 e 6,, e alcalino 8,5, a 45ºC Estas quitinases apresentaram comportamento compatível com glicoproteínas de elevado teor de carboidratos durante a purificação, pois houve pequena definição do saldo de cargas elétricas da proteína durante a realização das cromatografias de troca-iônica em resinas tanto aniônicas como catiônicas Os resultados obtidos durante e eletroforese e a dosagem de carboidratos, sugeriram que as quitinases poderiam estar associadas a outros carboidratos, possivelmente polissacarídeos produzidos durante o crescimento fúngico A produção de quitinases ativas em pH ácido foi maior que as ativas em pH alcalino em todas as condições testadas A atividade de quitinases com pH ótimo entre 5 e 6 foi detectada do 4º ao 9º dia de cultivo induzido enquanto que no cultivo sem indução quitinases ativas em pH ácido e alcalino, com pH ótimo de 8,5, foram detectadas com máximo de atividade no 5º dia de cultivo, diminuindo gradativamente até o 9º dia A amplificação do gene da quitinase resultou em um produto de aproximadamente 15pb para todas as cepas testadas e a análise do polimorfismo mostrou pouca variabilidade entre elas, uma vez somente 5 cepas apresentaram-se diferentes das demais não sendo possível correlacionar a ocorrência de variação com a mortalidade e a atividade enzimática
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Palavras-chave
Enzimas, Análise, Quitinase, Biotecnologia, Quitinase, Enzymes - Analysis, Biotechnology