Fusarium verticillioides : caracterização molecular e detecção em milho através de ensaio imunoenzimático

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dc.contributor.advisorOno, Elisabete Yurie Sataque [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorMeirelles, Paula Garciapt_BR
dc.contributor.bancaHirooka, Elisa Yokopt_BR
dc.contributor.bancaMarziale, Maria Helena Paluccipt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T12:42:08Z
dc.date.available2024-05-01T12:42:08Z
dc.date.created2005.00pt_BR
dc.date.defesa29.07.2005pt_BR
dc.description.abstractResumo: Fusarium verticillioides é um patógeno primário de milho e principal produtor de fumonisinas Este fungo pode causar perdas econômicas significativas para produtores e processadores de grãos, criadores de animais, além de representar sérios riscos à saúde humana e animal Este trabalho teve como objetivo desenvolver um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de F verticillioides em amostras de milho, avaliar a correlação entre esta metodologia e técnicas tradicionais de detecção de fungos e fumonisinas, assim como avaliar polimorfismos no gene FUM6 associado à biossíntese de fumonisinas, através de polimorfismo conformacional de fita simples Os polimorfismos encontrados foram associados à produção de fumonisina B1 (FB1) Para o desenvolvimento do ELISA competitivo indireto, foram obtidos exoantígenos de 8 isolados de F verticillioides, sendo que os antígenos de 3 isolados (97K, 113F e 162A), devido a maior concentração de proteínas e maior número de bandas protéicas visíveis em eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), foram selecionados para a produção de anticorpos policlonais O soro imune anti-97K, com maior título no ELISA indireto (1:128) foi escolhido para os ensaios posteriores Quarenta amostras de milho recém-colhido foram analisadas quanto à concentração de exoantígenos de F verticillioides, contagem de bolores e leveduras, e determinação de ergosterol e fumonisinas dos grãos, visando avaliar a correlação entre estes parâmetros F verticillioides foi também cultivado em meio líquido para a avaliação da correlação entre biomassa e exoantígenos O perfil eletroforético dos exoantígenos produzidos para o desenvolvimento do ELISA apresentou bandas com massas moleculares aparentes variando entre 17 e 17 kDa Não foi observada correlação significativa entre exoantígenos determinados por ELISA competitivo indireto e contagem total de bolores e leveduras, contagem de Fusarium spp e níveis de fumonisinas Por outro lado, o coeficiente de correlação entre exoantígenos e ergosterol foi 52, enquanto que entre biomassa e exoantígenos de F verticillioides em cultivo em meio líquido foi 84 Três isolados de F verticillioides apresentaram perfil eletroforético diferente dos demais, demonstrando que existe polimorfismo para o loco fum6 O isolado 97J apresentou polimorfismo na região correspondente ao sítio P45 da enzima, enquanto que os isolados 97L e 119Fa apresentaram polimorfismos na região do sítio "FAD-binding 1" A mutação no domínio P45 não parece estar associada ao aumento ou diminuição da produção de fumonisinas, uma vez que o isolado 97K produziu níveis intermediários de FB1 (15 µg/g), porém os isolados com polimorfismo no domínio "FAD-binding" apresentaram elevada produção de FB1 (2643 e 2814 µg/g respectivamente, para 97L e 119Fa) Os resultados obtidos sugerem que o ELISA com exoantígenos apresenta potencial para detecção de Fusarium spp em amostras de milho e que o gene FUM6 pode ser um marcador molecular para linhagens altamente toxigênicas de F verticillioidespt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Fusarium verticillioides is a primary corn pathogen and the main fumonisin producer This fungus can cause significant economical losses for the farmers, grain processors, animal producers and risk for human and animal health The aims of this study were to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect F verticillioides in corn samples and evaluate the correlation between this methodology and traditional methods of fungal and fumonisin detection, as well as analyse polymorphism in FUM6 gene, involved in fumonisins biosynthesis The polymorphisms observed were then correlated to fumonisin B1 (FB1) production Exoantigens from 8 F verticillioides strains were obtained for the development of an indirect competitive ELISA The exoantigens from 3 strains (97K, 113F and 162A) were selected for polyclonal antibody production, due to the highest protein concentration and high number of visible protein bands by denaturing polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) Antiserum against F verticillioides 97K exoantigens, which showed the highest titre in indirect ELISA (1:128), was chosen for further analyses Forty freshly harvested corn samples were analysed for F verticillioides exoantigens, as well as for total mould count, ergosterol and fumonisin levels in order to evaluate the relationship between these parameters In addition, F verticillioides was grown in brain heart infusion (BHI) broth, in order to evaluate the correlation between biomass and exoantigens The electrophoretic profile of the exoantigens produced for ELISA development showed protein bands with molecular mass ranging from 17 to 17 kDa There was no significant correlation between exoantigens and total mould count, Fusarium sp count and fumonisina levels Otherwise, the correlation coefficient between exoantigens and ergosterol content was 52 and between biomass and F verticillioides exoantigens in BHI broth was 84 Three strains of F verticillioides showed different electrophoretic profile from the others, demonstrating that there is polymorphism for fum6 locus Strain 97L showed polymorphism at the region corresponding to P45 conserved domain while strains 97L and 119Fa showed polymorphism at FAD_binding 1 domain The polymorphism at P45 domain is not apparently associated with high or low levels of FB1 synthesis, as it produced intermediate levels of FB1 (15 µg/g), however the strains which showed polymorphism at FAD_binding 1 domain presented high levels of FB1 (2643 and 2814 µg/g respectively, for strains 97L and 119Fa) The results suggest that the ELISA with exoantigens has potential for Fusarium sp detection in corn samples and that FUM6 gene can be a molecular marker for high fumonisin producer strains of F verticillioidespt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologiapt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10385
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameBiotecnologiapt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Exataspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-graduação em Biotecnologiapt_BR
dc.subjectMilhopt_BR
dc.subjectFusariopt_BR
dc.subjectFusarium verticillioidespt_BR
dc.subjectMicotoxinaspt_BR
dc.subjectFumonisinaspt_BR
dc.subjectCornpt_BR
dc.subjectMocotoxinspt_BR
dc.subjectFusariumpt_BR
dc.titleFusarium verticillioides : caracterização molecular e detecção em milho através de ensaio imunoenzimáticopt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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