Obtenção e utilização de anticorpos policlonais para análise de protease de Aggregatibacter actinomycetemcomitnas à imunoglobulina G em periodontites e infecção experimental em camundongos

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dc.contributor.advisorItano, Eiko Nakagawa [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorNakanishi, Fernanda Akemipt_BR
dc.contributor.bancaHirooka, Elisa Yokopt_BR
dc.contributor.bancaPelayo, Jacinta Sanchezpt_BR
dc.contributor.bancaWatanabe, Maria Angélica Eharapt_BR
dc.contributor.bancaVenâncio, Emerson Josépt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T13:13:08Z
dc.date.available2024-05-01T13:13:08Z
dc.date.created2008.00pt_BR
dc.date.defesa31.03.2008pt_BR
dc.description.abstractResumo: Aggregatibacter actinomycetemcomitans está freqüentemente associado a vários quadros de periodontites e infecções não orais Há controvérsias quanto aos dados de nível de imunoglobulinas específicas em pacientes com periodontites, o que pode ser decorrente da ação de protease de A actinomycetemcomitans O objetivo do trabalho foi obter e utilizar os anticorpos policlonais para a análise de protease à IgG humana em isolados de A actinomycetemcomitans, avaliar nível de IgG específica, analisar efeito de sobrenadante de cultivo de A actinomycetemcomitans no nível de IgG específica em salivas de pacientes com periodontites, avaliar nível de protease à imunoglobulina G no decorrer da infecção experimental em camundongos Foram obtidos inicialmente anticorpos policlonais de coelho e de camundongos por imunização dos mesmos com a fração cromatográfica de sobrenadante de cultura de Aa ATCC 43718 com atividade de protease Os anticorpos obtidos foram analisados por western blotting (WB) e por cromatografia em coluna de sephadex G-15 Esses anticorpos policlonais foram utilizados para determinar níveis de protease em amostras de sobrenadante de cultivo de isolados provenientes de pacientes com periodontite agressiva localizada (PAL) e com periodontite ulcerativa necrotizante associada à síndrome da imunodeficiência adquirida (PUN/SIDA), por ELISA captura Adicionalmente foi realizada a análise de nível de IgG anti-protease em amostras de salivas de pacientes com PAL e controles saudáveis e o efeito de sobrenadante de cultura de cepa de referência (ATCC 43718) no nível de IgG anti-leucotoxina em salivas de pacientes com PAL utilizando ELISA indireto Utilizando a mesma metodologia foi realizada a análise de nível de protease em tecidos e plasma além de anticorpo específico em camundongos BALB/c infectados por inoculação bucal de A actinomycetemcomitans (ATCC 43718 sorotipo b) nos dias 15, 3 e 6 pós-infecção Os resultados obtidos demonstraram que os anticorpos interagem com antígeno de ~5kDa por WB, sendo capazes reconhecerem as frações cromatográficas contendo atividade de protease Por ELISA captura, foi observado nível similar de protease nos isolados com PAL e PUN/SIDA Por ELISA indireto foi observado nível significativamente mais elevado de IgG anti-protease em grupo de salivas de pacientes com PAL em relação ao grupo saudável e após a incubação de salivas com sobrenadante de cultura houve decréscimo no nível de IgG específica em todas as amostras analisadas Em camundongos infectados foram observados níveis significativamente elevados de protease em tecidos e no plasma, sendo em nível maior na fase inicial da infecção para amostras de gengiva palatal enquanto que os níveis cardíaco e cerebral foram maiores na fase mais tardia (6 dias) Foi observado também aumento significativo no nível plasmático de IgG anti-protease em nível mais elevado no período de 15/3 que 6 dias pós-infecção Concluímos pelos resultados obtidos que a protease presente no sobrenadante de cultura de A actinomycetemcomitans possivelmente apresenta MM de ~5 kDa, que os níveis de protease à IgG são similares entre os isolados provenientes de pacientes com PAL e PUN/SIDA, que ocorre aumento no nível salivar de IgG específica e que os níveis de anticorpos específicos podem sofrer decréscimo pela atuação de sobrenadante de cultivo de A actinomycetemcomitans, sugerindo potencial desse microrganismo em alterar título de anticorpos na saliva Concluímos também que a infecção bucal de camundongos com A actinomycetemcomitans induz aumento no nível de protease à IgG, tanto localmente como de forma sistêmica e, se esse aumento interfere na diminuição de IgG específica à A actinomycetemcomitans no decorrer da infecção, requer estudos adicionaispt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Aggregatibacter actinomycetemcomitans is frequently associated to periodontitis and extra oral infections The immunoglobulins specific’s level controversies in the literature could be due to the protease released by this microorganism with capacity of degrading immunoglobulin G The objective of present work was to produce policlonals antibodies to A actinomycetemcomitans protease and to use these antibodies for the protease dosage in A actinomycetemcomitans clinical isolates, for evaluate the salivary specific IgG levels and for the effect of culture supernatants in salivary specific IgG level from periodontitis patients and also for evaluate the protease levels and specific IgG levels in the course of the experimental infection in mice Initially, rabbit and mice policlonal antibodies were obtained by using protease fraction (Aa ATCC 43718 sephadex G-15 chromatography fractions) and analyzed by western blotting (WB) and by chromatography fractions interactions By using these antibodies, the levels of protease were determined in A actinomycetemcomitans culture supernatants (A actinomycetemcomitans isolated from localized aggressive periodontitis (LAP), with necrotizing ulcerative periodontitis associated to acquired immunodeficiency syndrome NUP/AIDS) and reference Aa ATCC 43718), by ELISA capture Additionally salivary IgG anti-protease level and the effect of Aa ATCC 43718 culture supernatant in the level of IgG anti-leucotoxin were determined by indirect ELISA Also the protease levels in palatal, cardiac and cerebral tissues and plasma from BALB/c mice infected with oral inoculation of A actinomycetemcomitans (ATCC 43718 serotype b) were analyzed by ELISA capture, at 15, 3 and 6 days post-infection (pi) Additionally IgG anti-protease to IgG level was determined by indirect ELISA The results showed the antibodies interaction with ~5kDa antigen by WB, and also recognition of protease active chromatography fractions By ELISA capture, it was observed protease levels are similar between clinical isolated of LAP and PUN/AIDS group Also higher IgG anti-protease level was detected in the PAL salivary samples in relation to healthy group by indirect ELISA According to expected after the incubation of saliva with culture supernatants it was observed decreased specific IgG level In conclusion, the A actinomycetemcomitans protease to IgG possibly presents MM of ~5 kDa, it was observed protease levels are similar between clinical isolated of LAP and PUN/AIDS group Also the salivary IgG anti-protease is increased in PAL patients and the specific salivary antibodies levels can be decreased by soluble proteases presents in A actinomycetemcomitans culture supernatants, suggesting potential of this microorganism in altering title of antibodies in the saliva In infected mouse it was observed significantly increased levels of protease to IgG in plasma and infected tissues, with higher levels in the initial phase of the infection (15 days) in the palatal and later phase in cardiac and cerebral tissues Also significantly IgG anti-protease increased levels was observed in plasma of infected group, more evident in 15/3 than 6 days pi In conclusion, the A actinomycetemcomitans protease to IgG possibly presents MM of ~5 kDa, the protease levels are similar between clinical isolated of LAP and PUN/AIDS group, the salivary IgG anti-protease is increased in PAL patients and the specific salivary antibodies levels can be decreased by A actinomycetemcomitans culture supernatants, suggesting potential of this microorganism in altering title of antibodies in the saliva Also the oral A actinomycetemcomitans mice infection induces local as systemic increase in the protease level and, if this increased level interferes in the reduction of specific IgG to A actinomycetemcomitans in the course of the infection, require additional studiespt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em em Microbiologia) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologiapt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/11353
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameMicrobiologiapt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Biológicaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Microbiologiapt_BR
dc.subjectMicrobiologiapt_BR
dc.subjectActinonobacilluspt_BR
dc.subjectPeriodontitept_BR
dc.subjectMicrobiologypt_BR
dc.subjectPeriodontitispt_BR
dc.titleObtenção e utilização de anticorpos policlonais para análise de protease de Aggregatibacter actinomycetemcomitnas à imunoglobulina G em periodontites e infecção experimental em camundongospt_BR
dc.typeTesept_BR

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