Purificação, caracterização e aplicação de B-glicosidase de cotilédones de soja

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dataload.collectionmapped02 - Mestrado - Biotecnologiapt_BR
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dc.contributor.advisorRibeiro, Mara Lúcia Luiz [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorSantos, Rafael Fernandespt_BR
dc.contributor.bancaIda, Elza Ioukopt_BR
dc.contributor.bancaVaréa, Geni da Silvapt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T13:53:41Z
dc.date.available2024-05-01T13:53:41Z
dc.date.created2010.00pt_BR
dc.date.defesa19.02.2010pt_BR
dc.description.abstractResumo: A b-glicosidase (b-D-glicosídeo glicohidrolase, EC 32121) é uma enzima capaz de clivar as ligações b-glicosídicas de di e/ou oligosacarídeos liberando glicose e uma aglicona Esta enzima possui inúmeras funções endógenas nos vegetais, podendo ser utilizadas na hidrólise de isoflavonas glicosídicas (genistina, daidzina e glicitina) em agliconas (genisteína, daidzeína e gliciteína) que apresentam ação benéfica na saúde humana, atuando no controle e prevenção de doenças crônicas O objetivo deste trabalho foi purificar b-glicosidase de cotilédones de soja, caracterizá-la e aplicá-la em farinha de soja integral A b-glicosidase foi extraída de farinha de cotilédones com tampão fosfato de sódio 1 mM, pH 6,6, na proporção de 1:1 (p/v), com posterior acidificação com HCl ,1 N até pH 5, para obtenção do extrato bruto que foi fracionado com (NH4)2SO4 de -4% e 4-85% Os precipitados, ressuspensos em tampão fosfato citrato 5 mM, pH 5, e os sobrenadantes foram dialisados no mesmo tampão A fração com maior atividade de b-glicosidase (P4 85) foi concentrada por ultrafiltração e aplicada em coluna de troca iônica com CM Sephadex C-5, eluída por gradiente de NaCl –1 M em tampão fosfato-citrato, onde foram separadas quatro frações protéicas (F1, F2, F3, e F4) A fração F4, com maior atividade de b-glicosidase, foi aplicada em coluna de filtração em gel com Sephadex G-1, sendo separadas em três frações protéicas (F41, F42 e F43) O processo de purificação foi acompanhado por meio de eletroforese nativa em gel de poliacrilamida A b-glicosidase purificada foi caracterizada em relação a sua massa molecular e o efeito de íons metálicos e compostos orgânicos sobre sua atividade A b-glicosidase purificada e parcialmente purificada foi aplicada em farinha de soja integral sob diferentes condições de tratamentos utilizando um planejamento experimental com esquema fatorial 22 com dois níveis e triplicata no ponto central onde foi avaliada a influência das variáveis tempo de incubação e concentração da enzima na liberação de glicose A eletroforese nativa revelou uma única banda de proteína na fração F42, demonstrando que o processo de purificação de b-glicosidase foi eficiente A fração F42 apresentou massa molecular de 53 kDa por filtração em gel e 33 kDa por eletroforese em condições desnaturantes A atividade de b-glicosidase foi inibida por HgCl2 1 mM, glucona-d-lactona 1 mM e glicose 15 mM em 84, 94 e 84%, respectivamente O MnCl2 1 mM aumentou a atividade da enzima em 63% A aplicação da b-glicosidase em farinha de soja integral mostrou-se eficiente na liberação de glicose e consequentemente na liberação de isoflavonas agliconas, sendo os melhores resultados obtidos com 6 horas de incubação, independente da concentração de enzima utilizada A b-glicosidase purificada mostrou-se mais ativa na liberação de glicose em relação à parcialmente purificadapt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: b-glucosidase (b-D-glycoside glucohydrolase, EC 32121) is able to cleave di- and/or oligosaccharides b-glucoside linkages releasing glucose and aglycones This enzyme has many functions in plants and it can be used for hydrolysis of glucosidic isoflavones (genistin, daidzin and glicitin) in aglycones (genistein, daidzein and glycitein) that have a beneficial effect on human health, acting in the control and prevention of chronic deseases The objectives of this work was purify b-glucosidase from cotyledons of soybean, characterize it and apply it in soybean meal b-glucosidase was extracted from cotyledons meal with 1 mM sodium phosphate buffer, pH 6,6, at a ratio of 1:1 (w/v) and subsequent acidification with ,1 N HCl to pH 5, to obtain the crude extract that was fractionated with (NH4)2SO4 to -4% and 4-85% The pellet was dissolved in phosphate citrate buffer 5 mM, pH 5,, and the supernatants were dialysed in the same buffer The fraction with highest b-glucosidase activity (P4 85) was concentrated by ultrafiltration and loaded onto an ion exchange CM Sephadex C5 chromatography column, eluted with a –1 M NaCl gradient in 5 mM phosphate citrate buffer, separating four protein fractions (F1, F2, F3 and F4) F4 fraction that showed the highest b-glucosidase activity was loaded onto a gel filtration Sephadex G-1 column, separating three other protein fractions (F41, F42 and F43) The purification process was monitored by electrophoresis in native polyacrylamide gel The purified b-glucosidase was characterized for its molecular weight and the effect of metal ions and organics compounds on its activity Purified and partially purified b-glucosidase was applied to soybean meal under different treatments through an experimental 22 factorial design with two levels and three replicates at the central point, to evaluate the effect of incubation time and enzyme concentration in the release of glucose Native electrophoresis revealed a single protein band in fraction F42, demonstrating that b-glucosidase purification was efficient F42 fraction showed a molecular mass of 53 kDa by gel filtration and 33 kDa by electrophoresis under denaturing conditions b-glucosidase activity was inhibited by 1mM HgCl2, 1 mM glucono-d-lactone and 15 mM glucose at 84, 94 e 84%, respectively, while 1 mM MnCl2 increased the enzyme activity by 63% The application of b-glucosidase in soybean meal demonstrated that the enzyme was efficient in releasing glucose The best results were obtained with a period of 6 hours of incubation, independent of enzyme concentration The purified b-glucosidase fraction demonstrated higher activity in glucose release than the partially purifiedpt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologiapt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/12402
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameBiotecnologiapt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Exataspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-graduação em Biotecnologiapt_BR
dc.subjectEnzimaspt_BR
dc.subjectAplicações industriaispt_BR
dc.subjectAlimentospt_BR
dc.subjectBiotecnologiapt_BR
dc.subjectIsoflavonaspt_BR
dc.subjectEnzymespt_BR
dc.subjectFoodpt_BR
dc.subjectSoybean flourpt_BR
dc.subjectBiotechnologypt_BR
dc.subjectIndustrial applicationspt_BR
dc.titlePurificação, caracterização e aplicação de B-glicosidase de cotilédones de sojapt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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