Análise proteômica diferencial de Rhizobium tropici CIAT899 em resposta ao aminoácido L-triptofano

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dataload.collectionmapped02 - Mestrado - Genética e Biologia Molecularpt_BR
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dc.contributor.advisorRodrigues, Elisete Pains [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorYokoyama, Cátia Liept_BR
dc.contributor.bancaOliveira, André Luiz Martinez dept_BR
dc.contributor.bancaLopes, Fabrício Martinspt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T15:17:08Z
dc.date.available2024-05-01T15:17:08Z
dc.date.created2018.00pt_BR
dc.date.defesa28.03.2018pt_BR
dc.description.abstractResumo: Rhizobium tropici CIAT899 é uma bactéria simbiótica utilizada como inoculante comercial para o cultivo de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L) A simbiose entre rizóbios e plantas leguminosas resulta na formação de nódulos radiculares, órgãos especializados na troca de nutrientes entre as bactérias e a raiz aprimorando os benefícios da fixação biológica de nitrogênio (FBN) O estabelecimento da simbiose e formação dos nódulos é um processo complexo e regulado por ambos os parceiros, sendo o fitormônio auxina (ácido indol-3-acético; AIA), um dos fatores envolvidos na regulação do processo de biogênese do nódulo A ação do AIA já foi relatado atuação durante os estágios iniciais do processo de infecção, como o encurvamento do pêlo radicular, desenvolvimento do cordão de infecção, iniciação e diferenciação de nódulos Este fitormônio também é produzido por bactérias, inclusive por R tropici CIAT899, porém as vias de biossíntese e os fatores de regulação são ainda pouco estudadas Entre os fatores conhecidos que regulam a produção de AIA em bactérias está o precursor das vias de biossíntese, o aminoácido L-triptofano (TRP) Além do TRP, a produção de auxinas também é regulada pela disponibilidade de amônia (NH4+), um fator que interfere tanto na biossíntese de auxinas quanto no estabelecimento da simbiose e nodulação de leguminosas Devido à importância de AIA no estabelecimento de relações simbióticas entre rizóbios e leguminosas, o presente trabalho teve como objetivo analisar a produção de auxinas de CIAT899 na presença de TRP e amônia e comparar o proteoma de CIAT899 na presença e na ausência de TRP, visando identificar proteínas que sejam reguladas por este aminoácido Para os ensaios experimentais, CIAT899 foi cultivada em meio YM em quatro condições biológicas (sem TRP; com TRP; com NH4+; com TRP e NH4+), com três repetições A produção de auxinas foi avalizada por colorimetria com o reagente de Salkowski e o crescimento pela absorbância (DO6nm) Para análise protômica, as proteínas foram extraídas e digeridas com tripsina e os peptídeos obtidos foram analisados por cromatografia líquida em nano escala, acoplado à espectrometria de massa (nanoLC-MS/MS) As proteínas foram identificadas pela comparação do proteoma contra o genoma de CIAT899, sendo as proteínas diferencialmente expressas identificadas pela análise de T-fold no programa PatternLab As análises funcionais foram feitas com o auxílio das ferramentas Uniprot, KEGG Mapper e PATRIC Os dados obtidos revelaram que a produção de auxinas em CIAT899 é estimulada pelo L-triptofano, produzindo 28,56 µg/mL em 24 horas de cultivo enquanto a presença de amônia tem efeito negativo com reduções de até 61,2% A amônia é o principal produto da FBN e age como o principal regulador nas etapas finais de simbiose e nas reações envolvidas com a FBN, reforçando a importância da elucidação do papel do AIA nestes processos Na análise diferencial, entre YM versus YM+TRP, foram identificadas 617 proteínas totais, no qual 164 foram exclusivamente expressas na ausência de TRP, e 112 na presença de TRP Na análise utilizando KEGG permitiu mapear mais de 9 vias metabólicas, onde a via com maior número de identificações foi relacionado à biossíntese de metabólitos secundários Na análise utilizando o GO foram identificadas principalmente proteínas relacionadas à atividade catalítica, biossíntese de compostos celulares, e processos metabólicos e celulares A análise no TFold permitiu identificar 1 proteínas diferencialmente expressas que satisfazem ambos testes estatísticos (fold-change e p-value), 28 proteínas atenderam apenas o corte de Fold change e 8 proteínas que são consideradas diferencialmente expressas, mas apresentaram baixa abundância Entre as proteínas diferencialmente expressas, destacam-se a fosfatase ácida, lactato desidrogenase, proteína periplásmica de ligação oligopeptidica, transportador ABC, proteína do locus B associada com invasão, succinoglucana ExoF, proteína da via de dissimilação da Fucose e três proteínas ribossomais 5S Os principais processos que foram alterados em resposta ao aminoácido triptofano foram: metabolismo de sideróforo, biossíntese de polissacarídeos de superfície celular, atividade de quimiotaxia e motilidade e biossíntese e metabolismo de aminoácidos aromáticos por CIAT899 Estes resultados evidenciam que a biossíntese de AIA ocorre por vias metabólicas dependentes de TRP que são reguladas pela disponibilidade de amôniapt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Rhizobium tropici CIAT899 is a symbiotic bacteria used as a commercial inoculant for comoon bean (Phaseolus vulgaris L) The symbiosis between rhizobia and leguminous plants results in the formation of root nodules, organs that specialize in the exchange of nutrients between bacteria and root, enhancing the benefits of biological nitrogen fixation (BNF) The establishment of symbiosis and formation of nodules is a complex process regulated by both partners, being the phytohormone auxin (indole-3-acetic acid; IAA), one of the factors involved in the regulation of the biogenesis process of the nodule The IAA has already been reported in the early stages of the infection process, such as root curving, infection thread development, nodule initiation and nodule differentiation This phytohormone is also produced by bacteria including R tropici CIAT899 However, the biosynthesis pathways and regulatory factors are still poorly understood Among the known factors that regulate the production of IAA in bacteria, the precursor of the biosynthesis pathways, the amino acid L-tryptophan (TRP), is one of the most important In addition to TRP, auxin production is also regulated by the availability of ammonia (NH+4), a factor that interferes with both auxins biosynthesis and the establishment of symbiosis and nodulation of legumes Due to the importance of IAA in establishing symbiotic relationships between rhizobia and legumes, the present study aimed to analyze the production of auxins by CIAT899 in the presence of TRP and ammonia and to compare the proteome of CIAT899 in the presence and absence of TRP, aiming to identify proteins that are regulated by this aminoacid For the experimental assays, CIAT899 was cultivated in YM medium in four biological conditions (without TRP, with TRP, with NH+4, with TRP and NH+4), with three replicates Auxin production was assayed by colorimetry with the Salkowski reagent and growth by absorbance (OD 6 nm) For proteomic analysis, the proteins were extracted and digested with trypsin and the peptides obtained were analyzed by nano-scale liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nanoLC-MS / MS) Proteins were identified by comparing the proteome against the genome of CIAT899, and the differentially expressed proteins were identified by the T-Fold analysis in the PatternLab software The functional analyzes were done in the tools, Uniprot, KEGG Mapper and PATRIC The data obtained showed that the production of auxins in CIAT899 is stimulated by L-tryptophan, producing 2856 µg / mL in 24 hours of cultivation while the presence of ammonia has a negative effect with reductions up to 612% Ammonia is the main product of FBN and acts as the main regulator in the final stages of symbiosis and in the reactions involved with FBN, reinforcing the importance of elucidating the role of IAA in these processes In the differential analysis, between YM and YM + TRP, 617 total proteins were identified, in which 164 were exclusively expressed in the absence of TRP, and 112 in the presence of TRP Analysis using KEGG allowed to map more than 9 metabolic pathways, in which the route with the highest number of identifications was the biosynthesis of secondary metabolites In the GO analysis, proteins related to catalytic activity, part of the cell and metabolic and cellular processes were identified The analyzes in the TFold were identified 1 differentially expressed proteins that satisfy both statistical tests (fold-change and p-value), 28 proteins attended only the cut of Fold change and 8 proteins that are considered differentially expressed, but presented low abundance In the analysis of differentially expressed proteins were include acid phosphatase, lactate dehydrogenase, oligopeptide binding periplasmic protein, ABC transporter, B locus associated protein with invasion, ExoF succinoglucan, fucose dissimilation pathway protein and three 5S ribosomal proteins The main processes that were altered in response to the amino acid tryptophan were: siderophore metabolism, cell surface polysaccharide biosynthesis, chemotaxis and motile activity and biosynthesis and metabolism of aromatic amino acid by CIAT899 These results show that the biosynthesis of AIA occurs by metabolic pathways that are regulated by the availability of ammoniapt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecularpt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/16946
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameGenética e Biologia Molecularpt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Biológicaspt_BR
dc.relation.institutionnameEMBRAPApt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecularpt_BR
dc.subjectFeijãopt_BR
dc.subjectCultivopt_BR
dc.subjectRhizobium tropici CIAT899pt_BR
dc.subjectL-tryptophanpt_BR
dc.subjectBeanpt_BR
dc.subjectCultivationpt_BR
dc.titleAnálise proteômica diferencial de Rhizobium tropici CIAT899 em resposta ao aminoácido L-triptofanopt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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