Produção e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas

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dc.contributor.advisorAlmeida, Ricardo Sérgio Couto de
dc.contributor.authorSouza, Patricia Canteri de
dc.contributor.bancaKobayashi, Renata Katsuko Takayama
dc.contributor.bancaOgatta, Sueli Fumie Yamada
dc.contributor.bancaPavanelli, Wander Rogério
dc.contributor.bancaAndrade, Fábio Goulart de
dc.contributor.coadvisorVenâncio, Emerson José
dc.coverage.extent138 p.
dc.coverage.spatialLondrina
dc.date.accessioned2024-07-24T18:11:09Z
dc.date.available2024-07-24T18:11:09Z
dc.date.issued2021-03-31
dc.description.abstractO ferro é essencial para a funcionalidade dos processos biológicos, no entanto, o excesso de ferro é tóxico. Em humanos, ante sua toxicidade, esse metal é encontrado acoplado às proteínas, como a transferrina, que transporta o ferro para os tecidos, e a ferritina, molécula de armazenamento intracelular desse íon. Durante uma infecção, os microrganismos adquirem ferro do hospedeiro para sobreviver. Candida albicans, um dos principais patógenos responsáveis por doenças fúngicas graves, contém uma proteína transmembrana, a permease de ferro de alta afinidade Ftr1, que é utilizada para obter o ferro da ferritina, da transferrina, e de quelantes de ferro sintetizados por outros microrganismos. Na busca por novos mecanismos para conter a multiplicação fúngica, anticorpos são aplicáveis desde que é possível produzir anticorpos específicos contra estruturas microbianas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi produzir e realizar a caracterização biológica de anticorpos de gemas de ovos (IgY) contra a permease de ferro Ftr1 de C. albicans. Um peptídeo derivado de Ftr1 foi sintetizado e utilizado para imunizar galinhas poedeiras sete vezes. Os ovos das galinhas pré-imunizadas e após 3ª, 5ª, e 7ª imunizações foram coletados. Anticorpos IgY foram extraídos das gemas desses ovos pela técnica de precipitação por sulfato de amônio. Posteriormente, foram purificados por cromatografia, e as amostras contendo proteínas foram analisadas por eletroforese. Em seguida, foi realizado um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para averiguar a reatividade das imunoglobulinas. Também foi realizado um ELISA de avidez para estabelecer a força da ligação do antígeno com os anticorpos. A atividade antimicrobiana in vitro foi estabelecida por microdiluição em meio com diferentes concentrações de ferro. Adicionalmente, a concentração fungicida mínima foi determinada. Testes in vivo para averiguar o efeito antifúngico das imunoglobulinas foram realizados em larvas da mariposa Galleria mellonella, um modelo alternativo de infecção sistêmica. Em relação aos resultados, a produção, extração e purificação, se procederam com sucesso, sendo possível observar a presença das bandas correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgY no gel de eletroforese. Além disso, após purificação eliminaram-se os contaminantes. A imunoglobulina foi reativa ao antígeno, e a avidez aumentou gradativamente, sendo elevada após a 7ª imunização. A IgY extraída após a 7ª imunização inibiu o crescimento de C. albicans, da ∆ftr1, além de exibir ação candidacida. Outrossim, a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas e tratada com os anticorpos foi 90% maior do que o grupo controle, o qual não recebeu tratamento. Portanto, esse anticorpo mostrou ter atividade contra C. albicans, sendo capaz de aumentar a sobrevida de larvas infectadas com a levedura. Dado o crescente uso de hospedeiros alternativos na pesquisa, uma revisão a respeito do uso do besouro Tenebrio molitor como hospedeiro invertebrado para o estudo de infecções fúngicas também foi escrita. Nessa revisão foi constatado que T. molitor representa um modelo em ascensão, que pode ser utilizado no estudo da virulência fúngica, dos efeitos das micotoxinas, das respostas imunológicas do hospedeiro à infecção por fungos, e da ação de antifúngicos.
dc.description.abstractother1Iron is essential for the functionality of biological processes, however, excess iron is toxic. In humans, due to its toxicity, this metal is found coupled to proteins, such as transferrin, which transports iron to tissues, and ferritin, an intracellular storage molecule of this ion. During an infection, microorganisms obtain iron from the host to survive. Candida albicans, one of the main pathogens responsible for serious fungal diseases, contains a transmembrane protein, high-affinity iron permease Ftr1, which is used to obtain iron from ferritin, transferrin, and iron chelators synthesized by other microorganisms. In the search for new mechanisms to contain fungal multiplication, antibodies are applicable since it is possible to produce specific antibodies against a microbial structure. In this context, the work objective was to produce and perform the biological characterization of egg yolk antibodies (IgY) against the Ftr1 iron permease of C. albicans. A peptide derived from Ftr1 was synthesized and used to immunize laying hens seven times. Eggs from pre-immunized chickens and post-3rd, 5th, and 7th immunizations were collected. IgY antibodies were extracted from egg yolks by the ammonium sulfate precipitation technique. Subsequently, they were purified by chromatography, and samples containing proteins were analyzed by electrophoresis. Then, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to check the reactivity of immunoglobulins. An avidity ELISA was also performed to establish the binding strength of the antigen with the antibodies. The antimicrobial activity in vitro was carried out by microdilution in a medium with different concentrations of iron. Also, the minimum fungicidal concentration was provided. In vivo tests to determine the antifungal effect of immunoglobulins were performed on larvae of the moth Galleria mellonella, an alternative model of systemic infection. Regarding the results, the production, extraction, and purification occurred successfully, being possible to observe the presence of bands corresponding to the heavy and light IgY chains in the electrophoresis gel. Besides, after purification, contaminants were removed. The immunoglobulin was reactive to the antigen and the avidity gradually increased, being elevated after the 7th immunization. IgY extracted after the 7th immunization inhibited the growth of C. albicans, ∆ftr1, and also showed candidacidal action. Furthermore, the survival of infected G. mellonella larvae and treated with antibodies was 90% higher than the control group, which did not receive treatment. Therefore, this antibody has been shown to have activity against C. albicans, being able to increase the survival of larvae infected with yeast. Given the increasing use of alternative hosts in research, a review of the use of the Tenebrio molitor beetle as an invertebrate host for the study of fungal infections has also been written. In this review, it was discovered that T. molitor represents an emerging model that can be used to study fungal virulence, the effects of mycotoxins, the host's immune responses to fungal infection, and the action of antifungals.
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/17075
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCB - Departamento de Microbiologia
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Microbiologia
dc.subjectImunoterapia
dc.subjectAntimicrobiano
dc.subjectImunoglobulina Y
dc.subjectVia redutiva
dc.subjectCandidíase
dc.subjectMini-hospedeiros
dc.subject.capesCiências Biológicas - Microbiologia
dc.subject.keywordsImmunotherapy
dc.subject.keywordsAntimicrobial
dc.subject.keywordsImmunoglobulin Y
dc.subject.keywordsReductive pathway
dc.subject.keywordsCandidiasis
dc.subject.keywordsMini-hosts
dc.titleProdução e caracterização biológica de anticorpos IgY contra a permease de ferro Ftr1 de Candida albicans, e uso de insetos como modelos de infecções fúngicas
dc.title.alternativeProduction and biological characterization of igy antibodies against ftr1 iron permease of candida albicans, and use of insects as fungal infections models
dc.typeTese
dcterms.educationLevelDoutorado
dcterms.provenanceCentro de Ciências Biológicas

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