Padronização de uma semi-nested PCR em única etapa para a detecção molecular de fungos patogênicos

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dc.contributor.advisorVenâncio, Emerson José [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorPitz, Amanda de Fáveript_BR
dc.contributor.bancaItano, Eiko Nakagawapt_BR
dc.contributor.bancaTelles Filho, Flávio de Queirozpt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T14:00:37Z
dc.date.available2024-05-01T14:00:37Z
dc.date.created2011.00pt_BR
dc.date.defesa28.02.2011pt_BR
dc.description.abstractResumo: Na tentativa de contribuir para um diagnóstico mais rápido e preciso para infecções fúngicas, uma reação de semi-nested PCR em única etapa foi desenvolvida com oligonucleotídeos iniciadores para a região ITS do DNA ribossomal O limite de detecção desta reação foi de 2,5 pg para DNA dos fungos P brasiliensis e H capsulatum Não foram observadas reações cruzadas com os fungos Candida albicans, Sporothrix schenkii, T rubrum e Cryptococcus sp Para avaliar a eficiência da semi-nested PCR em única etapa desenvolvida neste estudo, fizemos a sua comparação com outras reações baseadas na reação em cadeia da polimerase (nested e semi-nested PCR) para identificação do fungo P brasiliensis, utilizando DNA extraído de cultura e também de amostras de escarro de pacientes portadores da infecção No total foram comparadas quatro reações diferentes, sendo duas de nested-PCR, uma de semi-nested PCR e uma de semi-nested PCR em única etapa (desenvolvida neste estudo), todas utilizam como alvo sequências das regiões espassadoras internas - Internal Transcribed Spacer (ITS1 e ITS2), caracterizada por possuir regiões altamente conservadas e regiões altamente específicas Os resultados nos mostraram que o método de Imai et al (2) é o que apresenta menor limite de detecção (2,5 ng), enquanto que a reação de Theodoro et al (25) tem um limite de até 25 pg, enquanto a reação de Koishi et al (21) apresentou um limite de detecção de 2,5 pg, assim como a semi-nested PCR em única etapa desenvolvida neste estudo A comparação também foi realizada com 14 amostras de escarro, sendo que a semi-nested PCR em única etapa e a reação de Koishi et al (21) foram positivas para todas as amostras, enquanto que as reações de Theodoro et al (25) e Imai et al (2) foram positivas para 8 e 4 amostras respectivamente Foi também observado que a principal causa da diferença dos limites de detecção e do número de amostras clínicas positivas entre as reações foi o número de ciclos, uma vez que com o aumento do número de ciclos foi observado um aumento do limite de detecção e da quantidade de amostras clínicas para ambas as reações A reação de semi-nested PCR em única etapa desenvolvida neste trabalho mostrou um limite de detecção semelhante a outras reações descritas na literatura, porém ela é mais rápida e menos propensa a contaminação do que as reações já descritas Além disso, pode ser modificada para detecção de outros fungos patogênicos pela utilização de oligonucleotídeos iniciadores específicos Por isso, esta reação de semi-nested PCR tem um grande potencial para ser utilizada no âmbito do diagnóstico molecular de infecções fúngicaspt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: In an attempt to contribute to a faster and more accurate diagnosis for fungal infection, a one tube semi-nested PCR was developed with primers for the ITS region of ribosomal DNA The detection limit of this reaction was 25 pg of DNA from fungi P brasiliensis and H capsulatum No cross reactions with the fungus Candida albicans, Sporothrix schenkii, T rubrum and Cryptococcus sp was observed To evaluate the efficiency of one tube semi-nested PCR developed in this study, we compared with other reactions based on polymerase chain reaction (nested and semi-nested PCR) for identification of the fungus P brasiliensis, using DNA extracted from culture, and sputum samples from patients with the infection A total of four different reactions were compared, two nested-PCR, a semi-nested PCR and a one tube semi-nested PCR (developed in this study), all use as target sequences of Internal Transcribed Spacer (ITS1 and ITS2), characterized by presenting highly conserved regions and highly specific regions The results show that the method of Imai et al (2) is due to a lower detection limit (25 ng), whereas the reaction of Theodoro et al (25) presents a limit of 25 pg, while the response of Koishi et al (21) shows a limit detection of 25 pg, as well as the one tube semi-nested PCR developed in this study The comparison was also performed with 14 sputum samples, and the semi-nested PCR (Koishi et al, 21) and one tube semi-nested were positive for all samples, while the reactions of Theodoro et al (25) and Imai et al (2) were positive for 8 and 4 samples respectively It was also noted that the main cause of the difference of detection limits and the number of positive clinical samples from the reactions was the number of cycles, since the increase in the number of cycles was observed an increase in detection limit and the amount clinical samples for both reactions The reaction of one tube semi-nested PCR developed in in this study showed a detection limit similar to other reactions described in literature, but it is faster and less prone to contamination than the reactions described above Moreover, it can be modified to detect other pathogenic fungi by using specific primers Therefore, this reaction semi-nested PCR has great potential to be used in the molecular diagnosis of fungal infectionspt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Patologia Experimental) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós- Graduação em Patologia Experimentalpt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/12601
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenamePatologia Experimentalpt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Biológicaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Patologia Experimentalpt_BR
dc.subjectPatologia experimentalpt_BR
dc.subjectFungos patogênicospt_BR
dc.subjectDiagnóstico molecularpt_BR
dc.subjectParacoccidioidomicosept_BR
dc.subjectMicoses fungóidespt_BR
dc.subjectExperimental pathologypt_BR
dc.subjectMolecular diagnosispt_BR
dc.subjectPathogenic fungipt_BR
dc.titlePadronização de uma semi-nested PCR em única etapa para a detecção molecular de fungos patogênicospt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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