Padronização de PCR tradicional e em tempo real para detecção de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em alimentos
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Bento Casaril, Kérley Braga Pereira
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Resumo
Resumo: Campylobacter jejuni e Campylobacter coli são freqüentemente associadas à campilobacteriose humana, com mais de 8% das infecções causadas por C jejuni A infecção é esporádica e os surtos são raros Além de gastrenterite, C jejuni também tem sido associada a doenças auto-imunes pós-infecção, incluindo artrite, síndrome de Guillain-Barré (SGB), síndrome de Miller-Fisher e síndrome de Reiter Aves e produtos avícolas têm sido implicados como os principais veículos para a infecção por Campylobacter Métodos convencionais de isolamento e de identificação de Campylobacter em alimentos geralmente utilizam meios de enriquecimento seletivo com posterior subcultivo em meios sólidos seletivos Estes métodos são muito demorados e após o isolamento, a identificação fenotípica requer testes bioquímicos e sorológicos adicionais Os métodos moleculares, como reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido padronizados para detecção, identificação e quantificação de Campylobacter spp em alimentos por serem rápidos, sensíveis e específicos Os objetivos deste estudo foram desenvolver um ensaio PCR multiplex para detecção e diferenciação entre C jejuni e C coli em carcaças de frango, além disso, quantificar C jejuni em culturas puras e detectar C jejuni em carcaças de frango artificialmente e naturalmente contaminadas, por PCR em tempo real A PCR multiplex foi desenvolvida utilizando iniciadores mapA específico para a detecção de C jejuni e iniciadores ceuE específicos para detecção de C coli A PCR multiplex desenvolvida foi testada em 11 diferentes isolados de Campylobacter e 22 espécies não-Campylobacter e a especificidade do ensaio padronizado foi de 1% A PCR multiplex padronizada foi também testada em carcaças de frango contaminadas artificialmente e naturalmente Campylobacter foi detectada a partir da pele de frango artificialmente contaminada com cerca de 5 unidades formadora de colônia (UFC) de Campylobacter por 1 g de pele após 48 h de enriquecimento seletivo Fragmentos específicos de PCR confirmaram a presença de C jejuni (22 pb) e/ou C coli (889 pb) em treze (46,4%) das 28 carcaças de frango adquiridas de supermercados locais de Londrina Para os ensaios de PCR em tempo real foram utilizados iniciadores mapA específico para a detecção de C jejuni Os testes de especificidade da PCR em tempo real empregando os iniciadores mapA para os isolados de Campylobacter e isolados de outras espécies bacterianas indicaram que apenas os isolados de C jejuni produziram os produtos de PCR com pico de dissociação de 76,3°C O limite de detecção da qPCR foi estimado em cerca de uma cópia de DNA por PCR para as culturas puras de C jejuni O ensaio PCR em tempo real foi testado em carcaças de frango contaminadas artificialmente e naturalmente C jejuni foi detectada a partir de peles de frango artificialmente contaminadas com aproximadamente 1, 1 ou 5 unidades formadoras de colônia (UFC) de C jejuni por 1 g de pele após 48 h de enriquecimento seletivo Os produtos de PCR específicos foram observados em todas as amostras analisadas pela PCR em tempo real, após 48 h de enriquecimento seletivo quando o DNA foi extraído por fervura usando Triton X-1 A PCR multiplex e a PCR em tempo real padronizadas mostraram serem métodos rápidos, sensíveis e específicos na detecção de Campylobacter em carcaças de frango quando comparado aos métodos convencionais, que exige 5 dias para um resultado negativo e 6-7 dias para confirmar um resultado positivo
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Palavras-chave
Campylobacter, Carne, Doenças, Alimentos, Microbiologia, Microbiology, Poultry as food, Polymerase chain reaction, Analysis, Food