Anticorpo monoclonal anti-AFB1 : coluna de imunoafinidade e espectrofluorimetria para controle de qualidade de alimentos

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dataload.collectionmapped02 - Mestrado - Ciência de Alimentospt_BR
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dc.contributor.advisorHirooka, Elisa Yoko [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorHayashi, Lucianapt_BR
dc.contributor.bancaItano, Eiko Nakagawapt_BR
dc.contributor.bancaSabino, Myrnapt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T12:40:12Z
dc.date.available2024-05-01T12:40:12Z
dc.date.created2007.00pt_BR
dc.date.defesa22.06.2007pt_BR
dc.description.abstractResumo: A freqüente ocorrência de aflatoxina em produtos agrícolas causa impacto negativo no agronegócio brasileiro A aflatoxina tem sido classificada em grupo 1 por International Association in Research on Cancer A produção de imunorreagentes aliada ao desenvolvimento de métodos imunoquímicos possibilitariam o controle de qualidade acessível e de baixo custo, visando prevenção de contaminação e fornecimento de alimentos seguros ao consumidor Considerando a necessidade em minimizar a dependência de importação de kits imunoquímicos para análise avançada de resíduos tóxicos na rotina laboratorial, introduziu-se a tecnologia de produção de anticorpo monoclonal (AcM) empregando hibridoma linhagem AF4, secretor de IgG específico para aflatoxina B1 (AFB1) O cultivo celular em meio sintético resultou em 632,63 mg de IgG purificada (82,18 mg/mL), superando a expectativa da obtenção de AcM descrito na literatura (5, mg/mL), sendo este atingido devido ao uso de L-glutamina e cultivo até morte celular O AcM anti-AFB1 semi-purificado e liofilizado foi utilizado na confecção da coluna de imunoafinidade (CIA) empregando suporte gel ativado Affi-Gel 1 A CIA Affi-Gel 1 de ,5 mL apresentou capacidade de retenção de 25,32 ng de AFB1, sendo a toxina eluída com 15 mL de metanol Para quantificação empregou-se a espectrofluorimetria, padronizando o comprimento de onda para 36nm de excitação e 42 nm de emissão, baseado na maior sensibilidade e estabilidade entre leituras consecutivas de AFB1 pura A CIA Affi-Gel 1 desenvolvida não foi totalmente eficaz na limpeza de milho artificialmente contaminado com AFB1 O capeamento da coluna ainda deve prosseguir com ensaios de melhoria, para atingir a eficácia equivalente à da CIA comercial Aflatest-P (VICAM) (recuperação de AFB1 de 72,4 a 79,77 %) Outrossim, considerando a especificidade comprovada de AcM anti-AFB1 produzido por meio do teste de capacidade de retenção, deve-se prosseguir estudo inserindo novas condições de capeamento de coluna e ensaios de padronização Quanto à reutilização de CIA comercial Aflatest-P, após regeneração de coluna, os resultados mostraram-se variáveis, com 34,15 a 82,88 % de recuperação de AFB1 O fato indicou que as colunas comerciais podem inferir erro de análise se reutilizadas, contra-indicando o reuso Em suma, a produção de AcM IgG anti-AFB1 foi atingida com sucesso, sendo aconselhável proceder ultrafiltração na etapa de concentração e manutenção a 4º C para conservar a integridade e atividade biológica do anticorpo Assim, a disponibilidade de AcM específico, limpeza de extrato alimentar em única etapa cromatográfica, uso reduzido de solventes tóxicos e possibilidade de reutilização, justificam o desenvolvimento de CIA, visando minimizar o custo referente à aquisição e aplicação no controle de qualidadept_BR
dc.description.abstractother1Abstract: The frequent occurrence of aflatoxin in foodstuffs causes a potential negative impact on Brazilian agribusiness Aflatoxin has been classified in group 1 by International Association in Research on Cancer The production of immunoreagents associated with immunochemical assay developments could allow accessible and low cost quality control aiming prevention of contamination and safe food supply to consumers Considering the need in minimizing the dependence on immunochemical kits imports, which are essential to carry out advanced toxic residues analysis routinely in laboratories, the technology of monoclonal antibody (mAb) using hybridoma cell line AF4 that produces IgG against aflatoxin B1 (AFB1) was introduced Cell culture in synthetic medium raised 63263 mg of purified IgG (8218 mg/mL), overcoming the expectation described in literature, ie 5 mg/mL of mAb, due to the use of L-glutamine and cell culture until death Semi-purified and lyophilized mAb against AFB1 was used to prepare the immunoaffinity column (IAC) using activated Affi-Gel 1 immunoaffinity support IAC Affi-Gel 1 coupled with 5 mL of IgG-gel showed an AFB1 retention capacity of 2532 ng, with further toxin elution from IAC with 15 mL of methanol Spectrofluorimetry was used to quantify the AFB1, where the excitation and emission wavelengths were standardized to 36 and 42 nm, respectively, which were selected based on the best sensibility and stability through consecutive readings of pure AFB1 The IAC Affi-Gel 1 developed was not totally efficient concerning the cleaning-up of artificially contaminated corn with AFB1 The end-capping procedure must be continued to reach the effectiveness which is equivalent to the commercial IAC Aflatest-P (VICAM) (recovery of 724 to 7977 %) Nevertheless, taking into account the specific activity of mAb against AFB1, checked by the AFB1 retention capacity test, the following study should insert new conditions concerning column end-capping and standardizing assays The reusability of IAC Aflatest-P was evaluated after column regeneration, but the data were variable, reaching 3415 to 8288 % for AFB1 recovery Such data showed that the reuse of commercial IAC may lead to analysis error In short, the production of mAb against AFB1 was successfully reached It is also recommended a further procedure using ultrafiltration at the concentration step and antibody maintenance at 4º C to keep its integrity and biological activity Therefore, the availability of specific mAb, cleaning-up of food matrices extract in a single chromatographic step and also toxic solvents reduced usage and their possible reusability justify the IAC development bearing in mind the reduction in quality control costspt_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10196
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência de Alimentospt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Ciência de Alimentospt_BR
dc.subjectAlimentospt_BR
dc.subjectQualidadept_BR
dc.subjectAflatoxinapt_BR
dc.subjectFood - Qualitypt_BR
dc.subjectAflatoxinspt_BR
dc.titleAnticorpo monoclonal anti-AFB1 : coluna de imunoafinidade e espectrofluorimetria para controle de qualidade de alimentospt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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