Padronização e avaliação de um teste de Elisa competitivo utilizando a proteína recombinante MSP5-PR1 para o diagnóstico sorológico da anaplasmose bovina

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dc.contributor.advisorVidotto, Odilon [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorMarana, Elizabete Regina Marangonipt_BR
dc.contributor.bancaMachado, Rosângela Zacariaspt_BR
dc.contributor.bancaGarcia, João Luispt_BR
dc.contributor.bancaVidotto, Marilda Carlospt_BR
dc.contributor.bancaPereira, Ademir Benedito da Luzpt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T12:44:09Z
dc.date.available2024-05-01T12:44:09Z
dc.date.created2006.00pt_BR
dc.date.defesa24.03.2006pt_BR
dc.description.abstractResumo: Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina que se encontra distribuída mundialmente afetando regiões tropicais e subtropicais É transmitido por vetores, sendo a doença caracterizada clinicamente por febre, anemia hemolítica, perda de peso, aborto e morte A marginale possui seis Proteínas Majoritárias de Superfície (MSPs) caracterizadas e designadas MSP1a (15 kDa), MSP1b (1 kDa), MSP2 (36 kDa), MSP3 (86 kDa), MSP4 (31 kDa), MSP5 (19 kDa) Estas proteínas estão envolvidas em importantes eventos entre as células do hospedeiro e o parasita, como respostas humoral e celular, transporte de nutrientes, adesão e invasão de eritrócitos e variação antigênica A MSP5 é uma proteína altamente conservada entre o isolados estudados de diferentes regiões geográficas, inclusive centrale de Anaplasma centrale e A ovis O presente trabalho teve como objetivo padronizar e avaliar um teste imunoenzimático um teste imunoenzimático competitivo (cELISA-PR1), utilizando a rMSP5 do isolado PR1 de A marginale desenvolvido para o diagnóstico sorológico de anaplasmose O gene msp5 foi clonado no plasmídio pRSETB e expresso em Escherichia coli BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen®) O seqüenciamento do gene msp5 mostrou 98% identidade com os isolados Florida e Saint Maries, 97% com isolados Brasil-Pernambuco e Havana; e 91% com A centrale A proteína recombinante rMSP5 a partir do isolado PR1 (rMSP5-PR1) foi reconhecida pelo anticorpo de monoclonal ANAF16C1 em Western blotting O cELISA-PR1 e a IFI foram comparados com cELISA pela análise de 283 soros bovinos, sendo 135 amostras negativas oriundas da região de Santa Vitória do Palmar - RS, e 147 amostras de soros positivas de bovinos naturalmente infectados com A marginale que obtiveram densidade óptica inferior a ,49 em 49nm (DO49) através do cELISA foram selecionadas de 245 amostras da região Sul do Brasil Os testes apresentaram especificidade de 1% e 99,3%, sensibilidade de 1% e 98%, com um coeficiente kappa de ,993 e ,978, respectivamente Na comparação de cELISA-PR1 e IFI com cELISA, a análise de 245 amostras de soros de bovinos naturalmente infectados com A marginale na região de Sul do Brasil apresentou uma prevalência de 77,55%, 81,63% e 76,73% respectivamente, com especificidade de 96,7% e 98,9%, sensibilidade de 98,9%, 96,3% e um coeficiente kappa de ,956 e ,699, respectivamente Conclui-se, através dos resultados obtidos, que cELISA-PR1 pode ter uso semelhante ao cELISA em testes diagnósticos contra A marginale durante a infecção aguda, avaliação sorológica, e identificação de bovinos portadores sãos A soroprevalência de A marginale foi determinada em 223 amostras de soros de bovinos com dois anos de idade ou mais, da Região de Centro-Sul no Estado de Paraná: região de Ponta Grossa, Guarapuava e Laranjeiras; através da pesquisa de anticorpos da classe IgG contra A marginale por ensaio imunoenzimático de competição cELISA-PR1 De todos os soros bovinos analisados, 13 (58,74%) reagiram ao cELISA-PR1, uma porcentagem significativa de animais, sendo esta região de instabilidade de enzoótica, susceptível à infecção por A marginale e ao desenvolvimento de anaplasmose O tipo de exploração da propriedade, sistema de criação e manejo, a presença de outros animais (ovino, caprino, eqüinos, animais silvestres), forma de comercialização de animais não apresentou diferença significativa entre as variáveis analisadas apresentando p>,1pt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) is the ethiological agent of hemmolitic disease which affects flocks throughout the world, mainly in tropical regions It is transmitted by ticks infecting animals and humans, causing an economically important illness which is clinically characterized by fever, hemolytic anemia, weight loss, abortion; and during the acute phase of the infection, even death A marginale has six Major Surface Proteins (MSPs) characterized and designated MSP1a (15 kDa), MSP1b (1 kDa), MSP2 (36 kDa), MSP3 (86 kDa), MSP4 (31 kDa), MSP5 (19 kDa) These proteins are envolved in importants events between host cells and parasite, such as humoral and cellular responses, nutrient transportation, atchement and invasion of erythrocytes, and antigenic variation MSP5 is a highly preserved protein among the isolates studied from different geographical regions, including Anaplasma centrale and A ovis Its antigenic characteristics observed in epidemiological and immunological studies, molecular biology, nPCR, hybridization, sequencing and recombinant MSP5 protein enable its use in assays in the diagnosis of cattle anaplasmosis, giving these high sensitivity and specificity A modified competitive ELISA test was developed for the serological diagnosis of cattle with anaplasmosis using recombinant MSP5 protein (rMSP5) from PR1 isolate from A marginale, expressed by the plasmid pRSET B/msp5 in Escherichia coli BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen®) The antigenic characterization of the PR1 isolate from A marginale contributed to the identification of MSP5, preserved in the isolate A marginale studied The sequencing showed 98% identity with the isolates Florida and Saint Maries, 97% with isolates Brasil-Pernambuco and Havana; and 91% with A centrale The rMSP5-PR1 was recognized by the monoclonal antibody ANAF16C1 in Western Blotting The cELISA-PR1 and IFI were compared with cELISA by analyzing 283 cattle sera, being 135 negative sera samples in the Santa Vitória do Palmar region, RS, and 147 positive sera samples from cattle naturally infected with A marginale in the Londrina region, North of Paraná These samples presented specificity of 1% and 993%, sensitivity of 1% and 98%, k=993 e k=978 respectively In the comparison of cELISA-PR1 and IFI with cELISA, the analysis of 245 sera samples from cattle naturally infected with A marginale in the region of Londrina showed a prevalence of 7755%, 8163% and 7673% respectively, with specificity of 967% and 989%, sensitivity of 989% and 963%, k=956 and k= 699 respectively It can be concluded, through the results obtained, that cELISA-PR1 can have a similar usage as cELISA in diagnostic tests against A marginale during acute infection, serological surveys, and identification of persistently infected cattle A marginale prevalence was determined in 217 sera samples in 2-year old or older cattle, from the Center-South Region in the State of Paraná: Ponta Grossa, Guarapuava and Laranjeiras do Sul regions; through survey of antibodies IgG class against A marginale through immune-enzymatic assays by cELISA-PR1 competition From all the cattle sera examined, 13 (58,74%) reacted to cELISA-PR1 test, a significant percentage of animals, being this region of enzootic instability, susceptible to infection by A marginale and development of anaplasmosis The kind of exploration in the property, the breeding and handling system, the presence of other animals (ovine/caprine, horses, wild animals), and means of commercialization of animals were analyzed The statistical analysis showed that there were no significant differences among the analyzed variablespt_BR
dc.description.notesTese (Doutorado em Ciência Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animalpt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10517
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeDoutoradopt_BR
dc.relation.coursenameCiência Animalpt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências Agráriaspt_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-graduação em Ciência Animalpt_BR
dc.subjectSorologia veterináriapt_BR
dc.subjectAnaplasmosept_BR
dc.subjectBovinopt_BR
dc.subjectDoençaspt_BR
dc.subjectVeterinary serologypt_BR
dc.subjectAnaplasmosispt_BR
dc.subjectCattle - Diseasespt_BR
dc.titlePadronização e avaliação de um teste de Elisa competitivo utilizando a proteína recombinante MSP5-PR1 para o diagnóstico sorológico da anaplasmose bovinapt_BR
dc.typeTesept_BR

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