PCR em tempo real para detecção e quantificação de Aspergillus Westerdijkiae em grãos de café

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dataload.collectionmapped02 - Mestrado - Microbiologiapt_BR
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dc.contributor.advisorFungaro, Maria Helena Pelegrinelli [Orientador]pt_BR
dc.contributor.authorMorello, Luis Gustavopt_BR
dc.contributor.bancaVitorello, Claudia Barros Monteiropt_BR
dc.contributor.bancaCamargo, Luís Eduardo Aranhapt_BR
dc.coverage.spatialLondrinapt_BR
dc.date.accessioned2024-05-01T12:13:48Z
dc.date.available2024-05-01T12:13:48Z
dc.date.created2007.00pt_BR
dc.date.defesa09.02.2007pt_BR
dc.description.abstractResumo: Ocratoxina A (OA) é uma micotoxina encontrada tanto em grãos de café como na bebida preparada a partir de grãos contaminados O perfil toxicológico desta micotoxina inclui carcinogenicidade, nefrotoxicidade e imunotoxicidade O café é uma bebida extensivamente consumida no mundo e o Brasil se configura como o maior produtor de grãos de café do mundo Apesar do café não ser a principal fonte de OA no consumo humano, ações para evitar a presença deste metabólito em grãos de café são necessárias para diminuir a exposição humana a esta micotoxina OA foi descoberta em 1965, como um metabólito secundário de A ochraceus, mas após isso, várias outras espécies de Aspergillus e Penicillium foram descritas como produtoras de OA Atualmente, Aspergillus westerdijkiae é reconhecido como a mais importante espécie produtora de OA em grãos de café Aspergillus westerdijkiae é uma nova espécie de fungo que foi recentemente desmembrada a partir do taxon Aspergillus ochraceus Essa espécie é muito similar a A ochraceus e vários isolados previamente identificados como A ochraceus, agora são identificados como A westerdijkiae De acordo com a literatura, isolados de A westerdijkiae são muito freqüentes e a maioria deles é capaz de produzir grandes quantidades de OA Neste trabalho, vários isolados obtidos de amostras de grãos de café brasileiro, previamente identificados como A ochraceus foram comparados com aquelas de A westerdijkiae através das seqüências de nucleotídeos que codifica para a ß-tubulina De fato, a maioria (84%) foi reconhecida como pertencente à espécie A westerdijkiae Devido ao fato que isolados de A westerdijkiae freqüentemente produzem grandes quantidade de OA, desenvolveu-se um par de primers específico para detectar e quantificar esta espécie em grãos de café utilizando-se da técnica de PCR em tempo real O par de primers desenhado (Bt2Aw-F 5'TGATACCTTGGCGCTTGTGACG / Bt2Aw-R 5'CGGAAGCCTAAAAAATGAAGAG) permitiu a obtenção de um amplicon de 347 pb em todos os isolados de A westerdijkiae e nenhuma reação cruzada foi observada usando DNA de A ochraceus A especificidade deste par de primers para amplificar A westerdijkiae motivou a investigação da possibilidade de seu uso para quantificar A westerdijkiae em grãos de café Após inoculação e incubação de grãos de café, extrações de DNA e ensaios de cfu foram realizadas em intervalos de 48 h Embora uma x correspondência entre o número de genomas haplóides e cfu tenha sido observada, a estimativa dos números de cópia de genoma foi sempre maior do que os números de cfu Utilizando diluições seriadas (1-1 a 1-9) do DNA extraído de grãos de café infectados, e incubados por 48 h, detectou-se um sinal positivo até a diluição de 1-5, o que significa mais de 1 e menos de 1 cópias de genoma haplóide de A westerdijkiae Este valor também significa menos de 1 genomas haplóides por ,1 grama de grãos de café O nível de sensibilidade do PCR em tempo real foi 1 vezes maior do que a técnica de cfu Palavras-chaves: Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus ochraceus, ocratoxina A, PCR em tempo realpt_BR
dc.description.abstractother1Abstract: Ochratoxin A (OA) is a mycotoxin that has been found in coffee beans and coffee beverages Its toxicological profile includes carcinogenicity, nephrotoxicity and immunotoxicity Coffee beverage is extensively consumed in the world, and Brazil is the major producer of coffee beans in the world Even though coffee beverage is not the main source of OA in human consumption, actions to prevent its production in coffee beans would decrease the human exposure to this toxin OA was discovered, in 1965, as a secondary metabolite in A ochraceus, but after this, several other Aspergillus and Penicillium species were described as OA producers Nowadays, Aspergillus westerdijkiae is recognized as the most important OA producing species in coffee beans Aspergillus westerdijkiae is a new species of fungus that was recently dismembered from Aspergillus ochraceus This species is very similar to A ochraceus, and several isolates previously identified as A ochraceus are now identified as A westerdijkiae According to the literature A westerdijkiae is very common and most isolates are able to produce large amounts of OA By using â-tubulin sequences, we analyzed several isolates obtained from Brazilian coffee bean samples, previously identified as A ochraceus, to compare with those of A westerdijkiae In fact, most (84%) were recognized as A westerdijkiae Since this species consistently produces large amounts of OA, we developed a specific primer-pair for detecting and quantifying it in coffee beans by using real-time PCR The primer-pair designed (Bt2Aw-F 5'TGATACCTTGGCGCTTGTGACG / Bt2Aw-R 5'CGGAAGCCTAAAAAATGAAGAG) provided an amplicon of 347 pb in all A westerdijkiae and no cross-reaction was observed using DNA from A ochraceus The specificity of this primer-pair to amplify A westerdijkiae motivated us to use it for quantifying A westerdijkiae in coffee bean After inoculation of coffee bean samples and incubation, DNA extraction and cfu-assay were performed at 48 h intervals Although a correspondence between copy number of haploid genomes and cfu was observed, the estimative of genome copy numbers was always higher than cfu numbers By using serial dilutions (1-1 to 1-9) of DNA extracted from infected coffee beans after 48 h of incubation, we detected a positive signal up to 1-5 dilution, which means less than 1 and more than one single copy number of A westerdijkiae haploid genome This value also xii means less than 1 haploid genomes per 1 gram of coffee beans Real-time PCR sensitivity level was more than 1 times higher than the cfu techniquept_BR
dc.description.notesDissertação (Mestrado em Microbiologia) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologiapt_BR
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/10057
dc.languagepor
dc.relation.coursedegreeMestradopt_BR
dc.relation.coursenameMicrobiologiapt_BR
dc.relation.departamentCentro de Ciências da Saúdept_BR
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Microbiologiapt_BR
dc.subjectAlimentospt_BR
dc.subjectMicrobiologiapt_BR
dc.subjectAspergilluspt_BR
dc.subjectReação em cadeia de polimerasept_BR
dc.subjectMicotoxinaspt_BR
dc.subjectPolymerase chain reactionpt_BR
dc.subjectFood - Microbiologypt_BR
dc.subjectMicotoxicosespt_BR
dc.titlePCR em tempo real para detecção e quantificação de Aspergillus Westerdijkiae em grãos de cafépt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR

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