Transcriptoma in planta de Phakopsora pachyrhizi e caracterização funcional de genes envolvidos em mecanismos basais de sobrevivência e patogenicidade
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Resumo: O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja (Glycine max (L) Merrill), produto responsável por metade da produção agrícola nacional Entretanto, a produção dessa importante oleaginosa é afetada, dentre outros fatores, pela ação do fungo Phakopsora pachyrhizi (Sydow & P Sydow), causador da doença conhecida como ferrugem-asiática da soja (FAS) Por ser um fungo biotrófico obrigatório, o estudo de P pachyrhizi é limitado ao seu contato com o hospedeiro durante o processo de infecção Neste sentido, este trabalho utilizou a técnica de microdissecção a laser da lesão foliar, associada ao sequenciamento de alto desempenho, para a obtenção de sequências de transcritos do patógeno durante a interação com genótipos resistente e suscetível de soja (PI561356 e BRS 231, respectivamente) Os resultados obtidos através do sequenciamento do transcriptoma do fungo compreendem a identificação de 3635 unisequências de P pachyrhizi, que forneceram uma visão geral dos mecanismos moleculares e rotas biológicas ativas no patógeno aos dez dias após a infecção em soja, como metabolismo energético e de ácidos nucleicos, síntese proteica, além de processos de transcrição, biossíntese e transporte Transcritos relacionados a processos de exocitose, sinalização de vias metabólicas, dentre outros, se apresentaram enriquecidos entre os genótipos resistente e suscetível utilizados neste trabalho em relação ao transcriptoma obtido de P pachyrhizi Adicionalmente, transcritos relacionados a processos de metilação, transporte de sulfato, e resposta a espécies reativas de oxigênio, entre outros, também foram enriquecidos entre diferentes estruturas e fases de infecção do fungo como esporos germinados, apressório, haustório e lesão foliar Análises OrthoMCL comparando as unisequências geradas a partir do genoma de outras 15 espécies de fungos e oomicetos, incluindo outras espécies de ferrugens, identificaram famílias multigênicas conservadas entre as espécies analisadas, bem como famílias comuns a fungos causadores de ferrugens, e famílias encontradas exclusivamente em P pachyrhizi, com destaque para famílias relacionadas a sinalização de vias metabólicas e transportadores de membrana A predição de elementos de transposição ativos entre os 3635 transcritos, identificou diferentes famílias de retrotransposons e de transposons de DNA, e análises de RT-qPCR confirmaram os níveis de expressão de genes específicos observados no sequenciamento de alto desempenho Adicionalmente, sete genes potencialmente envolvidos em processos de sobrevivência e patogenicidade de P pachyrhizi, selecionados a partir do transcriptoma do fungo e de análises in silico, foram caracterizados funcionalmente via silenciamento gênico por RNA interferente Mediante a utilização da tecnologia de silenciamento gênico induzido pelo hospedeiro (Host-Induced Gene Silencing - HIGS), construções utilizando plasmídeos baseados no genoma do vírus do mosqueado do feijoeiro (Bean pod mottle vírus - BPMV) foram obtidas para os sete genes do fungo previamente selecionados As construções HIGS-BPMV foram inseridas em plantas suscetíveis de soja, e posteriormente inoculadas com P pachyrhizi Os resultados obtidos revelaram redução significativa nos níveis de transcritos e na patogenicidade do fungo para três dos sete genes silenciados Os resultados obtidos neste trabalho contribuem com o aumento do conhecimento sobre o transcriptoma do fungo P pachyrhizi, demostram a existência de uma maquinaria de silenciamento ativa nesse patógeno, e, consequentemente, que o silenciamento gênico baseado na técnica de HIGS-BPMV constitui uma ferramenta viável na caracterização funcional de genes do fungo, sendo identificados pelo menos três genes que ocasionaram reduções significativas na patogenicidade quando silenciados
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Palavras-chave
Soja, Ferrugem asiática, Phakopsora pachyrhizi (Patógeno), Phakopsora pachyrhizi, Transcritoma, Asian soybean rust, Soybean