Otimização de PCR em tempo real para detecção do gênero Leishmania e diferenciação das espécies Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis

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dc.contributor.advisorNakamura, Celso Vataru
dc.contributor.authorCorreia, Guilherme Ferreira
dc.contributor.bancaToma, Helena Keiko
dc.contributor.bancaTavares, Eliandro Reis
dc.contributor.coadvisorOgatta, Sueli Fumie Yamada
dc.coverage.extent73 p.
dc.coverage.spatialLondrina
dc.date.accessioned2026-07-10T19:47:25Z
dc.date.available2026-07-10T19:47:25Z
dc.date.issued2025-12-10
dc.description.abstractNeste estudo foi desenvolvido e validado uma multiplex-PCR em tempo real (M-qPCR), com alta sensibilidade e especificidade, para diferenciação de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Também foi otimizado um ensaio qPCR para a detecção do gênero Leishmania. Oligonucleotídeos iniciadores gênero-específicos e espécie-específicos foram desenhados com base na análise das sequências do minicírculo do kDNA (várias espécies), e da região espaçadora interna transcrita 2 (ITS2) do locus do RNA ribossomal de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis, respectivamente. O vetor plasmidial pUC57 contendo as sequências consensos alvos foi utilizado como controle positivo. Os amplicons nos ensaios de qPCR e M-qPCR apresentaram curvas de dissociação distintas, com picos de temperatura de fusão de 76 °C, para o gênero Leishmania, 82 °C para L. amazonensis e 81°C para L. braziliensis. Nenhuma amplificação foi observada nos controles negativos. O desempenho analítico da M-qPCR foi avaliado utilizando análise in silico e um painel de cepas de referência e clínicas, abrangendo espécies de protozoários, bactérias e fungos, exibindo 100% de especificidade. Além disso, o ensaio apresentou um limite de deteção de 1 cópia por reação para todos os alvos utilizando o controle positivo. Em síntese, o ensaio qPCR e a M-qPCR mostraram elevado desempenho diagnóstico, sendo capazes de detectar o gênero Leishmania e diferenciar L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em amostras clínicas, respectivamente, superando as limitações observadas nas metodologias convencionais para diagnóstico da leishmaniose.
dc.description.abstractother1In this study, a real-time multiplex PCR (M-qPCR) with high sensitivity and specificity was developed and validated for the differentiation of Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensis. A qPCR assay for the detection of the Leishmania genus was also optimized. Genus-specific and species-specific primer pairs were designed based on the analysis of minicircle kDNA sequences (several species) and the internal transcribed spacer 2 (ITS2) region of the ribosomal RNA locus of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis, respectively. The pUC57 plasmid vector containing the consensus target sequences was used as a positive control. Amplicons in qPCR and M-qPCR assays showed distinct dissociation curves, with melting temperature peaks of 76 °C for the genus Leishmania, 82 °C for L. (L.) amazonensis, and 81 °C for L. (V.) braziliensis. No amplification was observed in the negative controls. The analytical performance of M-qPCR was evaluated using in silico analysis and a panel of reference and clinical strains, covering protozoan, bacterial, and fungal species, exhibiting 100% specificity. In addition, the assay had a limit of detection of 1 copy per reaction for all targets using the positive control. In summary, qPCR and M-qPCR assays showed high diagnostic performance, being able to detect the Leishmania genus and differentiate L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in clinical samples, respectively, overcoming the limitations observed in conventional methodologies for the diagnosis of leishmaniasis.
dc.identifier.urihttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/19381
dc.language.isopor
dc.relation.departamentCCB - Departamento de Microbiologia
dc.relation.institutionnameUniversidade Estadual de Londrina - UEL
dc.relation.ppgnamePrograma de Pós-Graduação em Microbiologia
dc.subjectLeishmaniose
dc.subjectCurva de dissociação
dc.subjectDiagnóstico molecular
dc.subjectSYBR Green
dc.subjectqPCR
dc.subjectLeishmania amazonensis
dc.subjectLeishmania braziliensis
dc.subject.capesCiências Biológicas - Microbiologia
dc.subject.cnpqCiências Biológicas - Microbiologia
dc.subject.keywordsLeishmania
dc.subject.keywordsMelting curve
dc.subject.keywordsMolecular diagnosis
dc.subject.keywordsSYBR Green
dc.subject.keywordsqPCR
dc.titleOtimização de PCR em tempo real para detecção do gênero Leishmania e diferenciação das espécies Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis
dc.title.alternativeOptimization of real-time PCR for detection of the genus Leishmania and differentiation of the species Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensis
dc.typeDissertação
dcterms.educationLevelMestrado Acadêmico
dcterms.provenanceCentro de Ciências Biológicas

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