Navegando por Autor "Nagashima, Luciene Airy"
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Item Caracterização parcial de fator(es) hemolítico(s) de Arthrographis kalraeNagashima, Luciene Airy; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Ono, Mário Augusto; Nogueira, Marco AntonioResumo: No presente estudo, componentes solúveis de Arthrographis kalrae foram investigados em relação à imunogenicidade/antigenicidade e atividade hemolítica Para avaliação da imunogenicidade/antigenicidade, o estudo foi realizado utilizando cell-free antigens (CFA) e antígenos sonicados e anticorpos anti-CFA de coelho por imunodifusão (ID)/ELISA/western blotting e também análise de frações cromatográficas de Sephadex G-1 e G-2 por ELISA A atividade hemolítica foi estudada em duas etapas: na primeira foram utilizadas hemácias de carneiro e, na segunda, hemácias de camundongo e anticorpos de camundongo anti-CFA e anti-hemácia de camundongo sensibilizada com CFA (anti-He-CFA) Na segunda etapa, amostras de CFA na forma nativa, CFA aquecido (56 oC, 3 min) ou tratado com anti-He-CFA e as frações obtidas por cromatografia de CFA em coluna de Sephadex G-2, foram analisadas pelo teste de hemólise Adicionalmente, a reatividade de anti-He-CFA e anti-CFA com antígeno CFA foi analisada por ELISA utilizando frações de cromatografia de G-2 ou por western blotting Os resultados da primeira etapa demonstraram um pico de reatividade das frações de CFA em Sephadex G-1 e dois picos de reatividade em Sephadex G-2 com soro imune de coelho Os resultados de western blotting mostraram que anti-CFA de coelho reconheceram várias bandas com MM distintas, sendo o perfil diferenciado em relação ao preparado antigênico A análise de atividade hemolítica resultou em lise das hemácias de carneiro Utilizando eritrócitos de camundongo foi observada atividade lítica similar com CFA na forma nativa e CFA aquecido, e diminuição da atividade com amostras de CFA tratadas com anti-He-CFA, sugerindo especificidade dos anticorpos aos fatores responsáveis pela hemólise Atividade hemolítica foi observada nas frações obtidas por cromatografia em Sephadex G-2, também positivas com IgG de camundongo anti-He-CFA por ELISA Western blotting resultou em duas bandas principais com MM ~252 kDa e ~79 kDa reconhecidas por IgG de camundongo anti-He-CFA Conclui-se que o fungo A kalrae libera pelo menos dois componentes principais com antigenicidade, imunogenicidade e atividade hemolítica, os quais são termoestáveis e com MM > 2 kDa e ~79 kDaItem Caracterização parcial de fatores hemolíticos e citotóxicos de Arthrographis kalrae e imunomodulação no decorrer da infecção experimental murinaNagashima, Luciene Airy; Itano, Eiko Nakagawa [Orientador]; Hirooka, Elisa Yoko; Furlaneto, Márcia Cristina; Watanabe, Maria Angélica Ehara; Ono, Mário AugustoResumo: Arthrographis kalrae é um fungo dimórfico, neurotrópico e cosmopolita que vem sendo descrito como um raro patógeno humano com diversas manifestações clínicas Este estudo investigou as atividades hemolítica e citotóxica de antígenos solúveis (cell-free antigens - CFA) de A kalrae e a resposta imunopatológica ao fungo durante a infecção murina experimental CFA total e suas frações cromatográficas (Sephadex G-15/12) foram testados em hemácias de camundongo para hemólise por teste em placa com leitura a 55 nm, e em linhagem celular P3U1 para citotoxicidade por método de metiltiazolil tetrazólio (MTT) Para caracterizar melhor o fator hemolítico, anticorpos anti-hemácias isogênicas sensibilizadas com CFA foram produzidos e testados em ensaio de inibição Também, teste de hemólise foi realizado após aquecimento do CFA e a reatividade dos anticorpos foi analisada após tratamento com periodato Na infecção experimental, camundongos Balb/c foram inoculados intravenosamente com A kalrae (5x16 células) e a carga fúngica (unidades formadoras de colônias - CFU - e antigenemia por ELISA de inibição), análise histopatológica do cérebro, respostas imunes humoral (IgG e sub-classes IgG1, IgG2b e IgG2a, por ELISA) e celular (hipersensibilidade tipo tadio - DTH) e níveis de citocinas (IFN-y, IL-4, IL-1 e IL-17) séricos e cerebrais foram avaliados 7, 14, 28 e 56 dias após infecção Os resultados obtidos demonstraram atividades hemolítica e citotóxica em concentrações distintas e em frações de alta e baixa massa molecular (MM), respectivamente Os anticorpos obtidos inibiram a hemólise, mas não a citotoxicidade A atividade hemolítica não foi afetada pelo aquecimento e a sua maior reatividade foi detectada nas frações ricas em carboidratos, sendo essa atividade reduzida por tratamento com periodato Em camundongos infectados foi detectada maior carga fúngica na fase inicial, principalmente no baço, fígado e cérebro, com pequena resposta inflamatória, com perda de peso e apresentando alterações comportamentais No decorrer da infecção houve diminuição da carga fúngica, porém com CFU positivo em alguns órgãos mesmo após 56 dias de infecção Houve um aumento gradual no nível de IgG anti-A kalrae (IgG1>IgG2a>IgG2b) com permanência alta de antigenemia e de menor peso corporal no decorrer de infecção, em relação ao grupo controle Foi detectado aumento de resposta de DTH em 14 dias, ocorrendo diminuição após esse período Houve diminuição de IFN-y (14 a 56 dias), aumento de IL-4 (7 e 56 dias) e aumento (7 dias) ou diminuição (56 dias) de IL-17 no soro Diminuição nos níveis das citocinas foi observada no cérebro 56 dias após a infecção Concluímos que A kalrae secreta fatores solúveis com atividade hemolítica e citotóxica, sendo o primeiro de natureza glicoproteica, termoestável e de alta MM, possivelmente distinto do fator citotóxico Concluímos também que o isolado A kalrae induz alteração comportamental, perda de peso, imunodepressão celular com modulação sistêmica de citocinas, possivelmente para padrão de resposta Th2, induzindo também modulação de citocinas no cérebro na infecção experimental em camundongos