Armani, Alessandra Lourenço Cecchini [Orientador]Sanches, Larissa Juliani2024-05-012024-05-012019.00https://repositorio.uel.br/handle/123456789/9701Resumo: O melanoma, tem origem nos melanócitos e sua incidência vem crescendo nas últimas décadas, resultado da interação de fatores de risco genéticos (como mutação em BRAF) e ambientais (como exposição à radiação UV, por exemplo) Quando diagnosticado precocemente, o tratamento mais indicado é a remoção cirúrgica, porém quando encontra-se metastizado para linfonodos ou órgãos distantes é comum ser refratário aos tratamentos, levando a uma baixa sobrevida O melanoma é resistente a grande parte dos tratamentos disponíveis até o presente momento e alguns processos estão associados a essa resistência A resistência intrínseca envolve a regulação positiva de receptores tirosina quinase e a reativação de MAPK, enquanto a resistência adquirida tardiamente está relacionada com mutações concorrentes em RAS ou MEK, amplificação da forma mutante de BRAF ou splicing alternativo O estresse oxidativo está intimamente relacionado aos processos de iniciação, proliferação e metástase do câncer bem como na resistência à terapia Estudos com a metformina tem mostrado que esta pode exercer uma ação na inibição do desenvolvimento do câncer A metformina é atualmente o medicamento mais prescrito mundialmente para o tratamento do diabetes tipo 2 No câncer a metformina atua nas vias de sinalização LKB1 – AMPK e mTOR A inibição do mTOR perturba a síntese de proteínas, ocasionando uma ação antineoplásica direta nas células tumorais, através da inibição da progressão do ciclo celular e indução da apoptose e autofagia Outros estudos, mostram que a metformina desencadeia a apoptose através da regulação negativa de Bcl-2, ativando Bax, p53, desencadeando apoptose através de sinalização da ERK, dependentes e independentes de caspases, inibindo o proto-oncogene c-MYC e HIF-1a via AMPK Com base nos efeitos promissores da metformina e na resistência do melanoma aos tratamentos disponíveis, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da metformina em células de melanoma murino metastático B16F1 em dois modelos experimentais: in vitro e in vivo No modelo in vitro, analisamos a participação da metformina no processo de indução de resistência à dacarbazina (DTIC) Para isso um fenótipo de resistência à DTIC foi induzido em células B16F1 A indução da resistência foi feita através da exposição das células a concentrações crescentes de DTIC As células foram plaqueadas em garrafas de 25cm2 na concentração de 1x16 e expostas a DTIC (1µg / mL, 1µg / mL, 25µg / mL, 5µg / mL, 75µg / mL, 1 µg / mL e 125 µg / mL) As células foram consideradas resistentes quando a exposição a DTIC não causava sua morte Para analisar a interferência da metformina no processo de indução de resistência, as células foram pré-tratadas com metformina (6 µM) durante 7 passagens e então foram induzidas à resistência a DTIC, grupo denominado MET-DTIC As células foram coletadas em todas as passagens, para a análise de marcadores de estresse oxidativo 8-OH-DG, p53, Nrf2 e NF-kB Os resultados revelam que o fenótipo de resistência a DTIC nas células B16F1 foi induzido com o protocolo experimental utilizado e que a metformina é capaz de atenuar este processo de indução de resistência Além de prevenir a indução de resistência a metformina atua aumentando os níveis de antioxidantes celulares e modula vias de sinalização importantes para a quimiorresistência, aumentando a marcação nuclear de p53 e reduzindo a marcação nuclear de NF?B e Nrf2 Na avaliação do efeito da metformina no melanoma in vivo, dois objetivos distintos foram trabalhados: primeiramente foi avaliado o efeito da metformina no tratamento do melanoma metastático, bem como sua ação em conjunto com o quimioterápico DTIC, em um segundo momento, avaliamos a ação da metformina na implantação das células tumorais no pulmão Para responder o primeiro objetivo, os animais foram inoculados com células B16F1 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo (C+), onde os animais não foram tratados; grupo Metformina (MET), tratado com metformina na concentração de 2mg ip do 1o ao 14o dia; Grupo Dacarbazina (DTIC), tratado com dacarbazina concentração de 5mg/kg ip do 5º ao 1º dia; grupo Metformina + Dacarbazina (MET-DTIC), tratado com metformina e dacarbazina nas mesmas condições mencionadas acima; e grupo controle negativo (C-), em que os animais foram inoculados com meio de cultura (DMEM) sem soro e não receberam tratamento Para o segundo objetivo, todos os animais foram tratados com metformina na concentração de 2mg ip durante 5 dias, após esse período os animais foram inoculados com células B16F1 4x16 pelo plexo oftalmico, e divididos nos grupos: controle positivo PTM (C+), PTM (MET), PTM (DTIC) e PTM (MET-DTIC), seguindo os mesmos protocolos de tratamento descritos para o primeiro objetivo Nos dois protocolos experimentais, os animais foram pesados durante todo o tempo experimental e o consumo de ração por animal em cada grupo foi calculado Após os 14 dias de experimento, os animais foram eutanásiados e foi realizada a punção cardiaca para a análise sistêmica e a retirada cuidadosa dos pulmões Foram realizadas as contagens de nódulos metástaticos em todos os pulmões Foram realizadas análises de estresse oxidativo no microambiente tumoral e sistêmico A arquitetura pulmonar e marcadores de vias de sinalização envolvidas com proliferação, estresse oxidativo e morte celular também foram analisados devido à sua relação com a resistência aos tratamentos disponíveis Os resultados demonstram que a metformina tem um importante papel na modulação de importantes vias de sinalização, como a p53, PCNA e Nrf2, interferindo assim no estresse oxidativo e culminando em uma ação antitumoral e antimetastática Diminuindo assim o número de nódulos metastáticos quando utilizada isoladamente e potencializando o efeito da DTIC, além de diminuir os efeitos colaterais do quimioterápico Dessa forma pode-se concluir que a metformina tem um potencial terapêutico por apresentar atividade antitumoral em modelos in vitro e in vivo de melanoma murino, estudados com as células B16F1 Essa atividade é acompanhada pela modulação de vias importantes para a viabilidade de células tumorais como, estresse oxidativo, crescimento e morte celular resposáveis, em parte, pela resistência do melanoma a quimioterápicos atualmente disponíveisPatologia experimentalMelanomaEstresse oxidativoMetforminaExperimental pathologyMelanomaOxidative stressMetforminTese