Nakamura, Celso VataruCorreia, Guilherme Ferreira2026-07-102026-07-102025-12-10https://repositorio.uel.br/handle/123456789/19381Neste estudo foi desenvolvido e validado uma multiplex-PCR em tempo real (M-qPCR), com alta sensibilidade e especificidade, para diferenciação de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Também foi otimizado um ensaio qPCR para a detecção do gênero Leishmania. Oligonucleotídeos iniciadores gênero-específicos e espécie-específicos foram desenhados com base na análise das sequências do minicírculo do kDNA (várias espécies), e da região espaçadora interna transcrita 2 (ITS2) do locus do RNA ribossomal de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis, respectivamente. O vetor plasmidial pUC57 contendo as sequências consensos alvos foi utilizado como controle positivo. Os amplicons nos ensaios de qPCR e M-qPCR apresentaram curvas de dissociação distintas, com picos de temperatura de fusão de 76 °C, para o gênero Leishmania, 82 °C para L. amazonensis e 81°C para L. braziliensis. Nenhuma amplificação foi observada nos controles negativos. O desempenho analítico da M-qPCR foi avaliado utilizando análise in silico e um painel de cepas de referência e clínicas, abrangendo espécies de protozoários, bactérias e fungos, exibindo 100% de especificidade. Além disso, o ensaio apresentou um limite de deteção de 1 cópia por reação para todos os alvos utilizando o controle positivo. Em síntese, o ensaio qPCR e a M-qPCR mostraram elevado desempenho diagnóstico, sendo capazes de detectar o gênero Leishmania e diferenciar L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em amostras clínicas, respectivamente, superando as limitações observadas nas metodologias convencionais para diagnóstico da leishmaniose.porLeishmanioseCurva de dissociaçãoDiagnóstico molecularSYBR GreenqPCRLeishmania amazonensisLeishmania braziliensisDissertaçãoCiências Biológicas - MicrobiologiaCiências Biológicas - MicrobiologiaLeishmaniaMelting curveMolecular diagnosisSYBR GreenqPCR