NÁDIA CRISTINE WEINERT MODELO HEPÁTICO EX VIVO EM SUÍNOS: EFEITO DO ACETAMINOFENO, DA FUMONISINA E DO ÁCIDO FÍTICO Londrina 2020 NÁDIA CRISTINE WEINERT MODELO HEPÁTICO EX VIVO EM SUÍNOS: EFEITO DO ACETAMINOFENO, DA FUMONISINA E DO ÁCIDO FÍTICO Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciência Animal (Área de Concentração em Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito para a obtenção do título de Doutora em Ciência Animal. Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Frederico R. L. Bracarense. Londrina 2020 NÁDIA CRISTINE WEINERT MODELO HEPÁTICO EX VIVO EM SUÍNOS: EFEITO DO ACETAMINOFENO, DA FUMONISINA E DO ÁCIDO FÍTICO Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciência Animal (Área de Concentração em Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina como requisito para a obtenção do título de Doutora em Ciência Animal. BANCA EXAMINADORA ______________________________________ Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Frederico R. L. Bracarense Universidade Estadual de Londrina – UEL ______________________________________ Profa. Dra. Karina Keller Marques da Costa Flaiban Universidade Estadual de Londrina – UEL ______________________________________ Profa. Dra Heloisa Godoi Bertagnon Universidade do Centro-Oeste – UNICENTRO ______________________________________ Profa. Dra. Juliana Rubira Gerez Universidade Estadual de Londrina – UEL ______________________________________ rofa. Dra. Meire Christina Seki Universidade do Centro-Oeste – UNICENTRO Londrina, 20 de março 2020. 1 A Deus. Ao meu esposo e familiares. AGRADECIMENTOS 1 2 Em primeiro lugar agradeço a Deus, fonte imensurável de amor e por sempre 3 me mostrar que para Ele nada é impossível. Agradeço pela minha vida, pela minha 4 família, pelo amparo nos momentos difíceis e por ter me conduzido sempre pelo 5 melhor caminho. 6 Agradeço especialmente a minha orientadora, Profa. Dra. Ana Paula Frederico 7 Rodrigues Loureiro Bracarense, por ter concedido esta oportunidade. Agradeço 8 infinitamente a confiança, pois sem me conhecer, abriu as portas do Laboratório de 9 Patologia e da sua casa, compartilhando seus conhecimentos comigo. Sempre foi 10 gentil, mesmo sabendo das minhas atividades além de Londrina. Gratidão por todo o 11 conhecimento, apoio, compreensão e amizade que sempre demonstrou ter nas mais 12 diversas situações, do início ao término desta tese. Espero de coração, que possamos 13 continuar as parcerias na área da pesquisa. 14 Agradeço a banca de defesa de tese composta pela Profa. Dra. Juliana Rubira 15 Gerez, Profa. Dra. Karina Keller Marques da Costa Flaiban, Profa. Dra Heloisa Godoi 16 Bertagnon e Profa. Dra. Meire Christina Seki por aceitarem o convite e contribuírem 17 com seu conhecimento para a melhoria deste trabalho. 18 Aos meus colegas e amigos do Laboratório de Patologia Animal da 19 Universidade Estadual de Londrina, principalmente as meninas do meu coração: Juh, 20 Leilitcha, Dani, Thalita e Isa, pela boa disposição, bons momentos de descontração 21 no espetinho, no restaurante universitário, toda força transmitida, as boas risadas, 22 conversas e a nossa amizade que ficou. Agradeço a gentileza, carinho e auxilio na 23 execução deste projeto das ICs Thaynara e Ana Laura. Agradeço ao convívio e 24 carinho do pessoal do laboratório: Andressa, Ricardo, Marielen, Milton, Weslem, Elis, 25 Ana, Bárbara, Victor, Vivian, Gabi, Mari e Claudia. Principalmente aqueles que 26 ajudaram de forma integral durante a execução dos experimentos, sem a ajuda de 27 vocês nada disso seria possível. 28 As amigas que o “doutorado” me apresentou: Paula Fernanda Massini e Keli 29 Libardi Ramella, por toda força, apoio e conselhos. Vocês compartilharam comigo 30 momentos decisivos para que estivéssemos juntas neste período. Fomos as últimas 31 a participar da entrevista para o ingresso e aquele momento de ansiedade nos uniu e 32 assim pudemos traçar metas e objetivos durante estes quatro anos. Obrigada por 1 terem tornado a tarefa mais fácil e por todos os bons momentos de descontração! 2 Um agradecimento especial a minha amiga Suelen Suphoronski, que me 3 acolheu em sua casa durante todo o período do doutorado. Seu apoio e companhia 4 foram fundamentais para que conseguisse finalizar esta etapa. Obrigada! 5 Agradeço também ao Departamento de Medicina Veterinária da Unicentro 6 (DEVET) por ter possibilitado que eu pudesse me afastar e me deslocar até Londrina 7 para a realização das disciplinas e do projeto. 8 Gratidão a todos os alunos da Unicentro, que prontamente aceitavam participar 9 das incansáveis reposições em horários alternativos, o que contribuiu para a 10 finalização das disciplinas e tarefas em Londrina. 11 A professora Sônia Maria Kurchaidt do Departamento de Matemática da 12 Unicentro e amiga Juliana Rubira, pelo apoio nas análises estatísticas. 13 As minhas amigas com tudo o que o significado da palavra amizade implica! 14 Ana Elisa Machado, Kate Buzi e Laís Werner, por todos os conselhos, risadas e apoio 15 incondicional. Amo vocês! 16 À minha família, em especial a minha mãe, Juscélia Vieira Weinert (in 17 memorian) que semeou e cultivou em mim este amor por estudar e buscar 18 conhecimento. Gratidão minha mãe! Hoje sigo seus passos, aprendendo 19 constantemente e ensinando meus alunos. Desejo ter sempre a sua determinação e 20 alegria. Agradeço pela sua breve passagem em minha vida, porém fica o desejo do 21 nosso reencontro. 22 A minha vó Izilanda, exemplo de força e coragem, pelas energias sempre 23 positivas e pelos milhares de beijos e abraços virtuais que trocamos nestes quatro 24 anos. Ao meu pai, irmãos Aline e Luiz Guilherme e sobrinha Ágata Luiza, meus 25 grandes amores. Sem dúvida, as minhas conquistas são para vocês. Agradeço por 26 entenderem e apoiarem as minhas escolhas (mesmo achando que era loucura) e 27 compreenderem que muitas vezes a privação do nosso convívio, foi necessária para 28 minha formação e crescimento. 29 E em especial, ao meu marido/companheiro Mirodion Santos Oliveira, que 30 caminhou comigo lado a lado durante este período. Compreendeu minha ausência em 31 muitos momentos que poderiam ser compartilhados, renunciando da minha atenção, 32 carinho e disponibilidade, mas sempre entendendo todas as minhas necessidades. 1 Obrigada meu amor, por toda força, carinho e pelas comidas maravilhosas que eu 2 encontrava a cada retorno para casa. Perdoe-me pelas ausências. Obrigada por me 3 valorizar e por SEMPRE acreditar que eu era/sou capaz! Obrigada por fazer parte da 4 minha vida e por me fazer feliz. 5 Gratidão as nossas filhas (Lara, Margot, Mongris, Bazuca, Mitcha, Emy e Apis) 6 por deixarem a vida corrida do dia a dia mais serena e renovarem diariamente as 7 nossas energias com muito carinho e amor. 8 “Gratidão às forças superiores que sempre estão bem próximas” (Iria Graciete 9 Weinert Chaves). 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 “Desistir…eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério. É que tem mais chão nos meus olhos do que o cansaço nas minhas pernas, mais esperança nos meus passos do que tristeza nos meus ombros, mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça” Cora Carolina WEINERT, Nádia Cristine. Modelo hepático ex vivo em suínos: efeito do 1 acetaminofeno, da fumonisina e do ácido fítico. 2020. 90f. Tese (Doutorado em 2 Ciência Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2020. 3 4 RESUMO 5 6 Devido à similaridade orgânica ao homem, suínos são utilizados como modelos 7 experimentais. Os explantes ex vivo são promissores na avaliação de xenobióticos no 8 organismo. Assim, objetivou-se avaliar os efeitos da fumonisina (FB1), acetaminofeno 9 e do ácido fítico (IP6) utilizando-se o modelo de explante hepático de suínos. Foram 10 realizados dois experimentos, nos quais foram analisados: resposta ao estresse 11 oxidativo, morfologia e biomarcadores hepáticos. O experimento (E1) avaliou o efeito 12 de IP6 (5mM) nos explantes expostos ao acetaminofeno (20mM). Utilizou-se nove 13 suínos de terminação provenientes de frigoríficos (grupo experimental 1 - GE1) e seis 14 suínos com 40 dias (grupo experimental 2 - GE2), estes eutanasiados. Os explantes 15 (8 mm) passaram pelos seguintes tratamentos durante quatro horas: controle 4h 16 (somente meio); IP6 (5mM); acetaminofeno (20mM) e IP6 + acetaminofeno. Explantes 17 não incubados (Ctrl 0h) foram colhidos para comparação com incubados (Ctrl 4h). Os 18 sobrenadantes foram colhidos após 1/2h, 2h e 4h de incubação para análise de 19 biomarcadores (ALT, AST, FA, GGT, proteína e colesterol). Após 4h, (3/tratamento) 20 foram fixados, processados para análise histológica ou congelados (2/tratamento) a -21 80ºC, para avaliação do estresse oxidativo: substâncias reativas ao ácido 22 tiobarbitúrico (TBARS), tetrazólio de nitroazul (NBT), capacidade antioxidante por 23 meio da glutationa reduzida (GSH), potencial de redução do ferro (FRAP) e 24 capacidade de eliminação de radicais livres (ABTS). Para GE1 e GE2, na presença 25 de IP6, observou-se atividade enzimática menor de GGT e FA em relação ao controle. 26 Com acetaminofeno, a atividade enzimática (FA, AST, ALT), PT e colesterol reduziram 27 comparado ao controle. Para o GE2, notou-se queda de FA e ALT para acetaminofeno 28 mais IP6 em relação ao controle. Os explantes incubados apenas com meio de cultura 29 (Ctrl 4h) apresentaram aspectos histológicos similares aos não incubados (Ctrl 0h). 30 Assim, a incubação não interferiu na integridade do tecido. Para o ensaio TBARS 31 (GE1), ocorreu diferença entre controle 4h e acetaminofeno, menor para este último. 32 Estes achados indicam que provavelmente não houve peroxidação lipídica nos 33 explantes expostos ao acetaminofeno. Houve redução da GSH no grupo exposto ao 34 IP6. Para o GE2, houve aumento da capacidade antioxidante (GSH, FRAP e ABTS) 35 do grupo acetaminofeno comparado com controle 4h, IP6 e acetaminofeno acrescido 36 de IP6 e para o NBT diferença entre controle 4h e acetaminofeno, maior para este 37 último, indicando possível lesão oxidativa. No segundo experimento (E2), a 38 metodologia foi similar ao primeiro, sendo os explantes submetidos aos tratamentos: 39 controle 0h; controle 4h; IP6 (5mM); FB1 (100 µM); FB1 + IP6. Não houve diferença no 40 escore da lesão entre GE1 e GE2. Para o GE1 e GE2, os tratamentos IP6 e FB1 + IP6 41 diminuíram a atividade de FA em relação ao controle e FB1. Quando o IP6 foi 42 adicionado ao FB1, reduziu a atividade de ALT e PT comparado ao FB1 e ao controle. 43 Para o GE1 e GE2, a FB1 induziu ao aumento de GSH comparado ao IP6 e controle, 44 respectivamente, enquanto a incubação com FB1 + IP6 dimininui GSH em 45 comparação ao FB1. Os resultados obtidos evidenciaram uma ação protetora do IP6. 46 47 Palavras-chave: Biomarcadores. Estresse Oxidativo. IP6. Morfologia. Suínos.48 WEINERT, Nádia Cristine. Ex vivo liver model in swine: effect of acetaminophen, 1 fumonisin and phytic acid. 2020. 90p. Thesis (Doctorate degree in Animal Science) 2 – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2020. 3 ABSTRACT 4 Due to the organic similarity to man, pigs are used as experimental models. Ex 5 vivo explants are promising in the evaluation of xenobiotics in the body. Thus, the 6 objective was to evaluate the effects of fumonisin (FB1), acetaminophen and phytic 7 acid (IP6) using the swine liver explant model. Two experiments were carried out, in 8 which it where analyzed: response to oxidative stress, liver morphology and 9 biomarkers. The experiment (E1) evaluated the effect of IP6 (5mM) on explants 10 exposed to acetaminophen (20mM). Nine finishing pigs were used from 11 slaughterhouses (experimental group 1 - GE1) and six 40-day-old pigs (experimental 12 group 2 - GE2) were used, euthanized. The explants (8 mm) underwent the following 13 treatments for four hours: control 4h (media only); IP6 (5mM); acetaminophen (20mM) 14 and IP6 + acetaminophen. Un incubated explants (Ctrl 0h) were collected for 15 comparison with incubated. Supernatants were collected after 1 / 2h, 2h and 4h of 16 incubation for analysis of biomarkers (ALT, AST, FA, GGT, protein and cholesterol). 17 After 4h, (3 / treatment) were fixed, processed for histological analysis or frozen (2 / 18 treatment) at -80ºC, to assess oxidative stress: substances reactive to thiobarbituric 19 acid (TBARS), nitro-blue tetrazolium (NBT) and capacity antioxidant by means of 20 reduced glutathione (GSH), iron reduction potential (FRAP) and ability to eliminate free 21 radicals (ABTS). For GE1 and GE2, in the presence of IP6, less GGT and FA enzyme 22 activity was observed compared to the control. With acetaminophen, the enzymatic 23 activity (FA, AST, ALT), PT ando cholesterol decreased compared to the control. For 24 GE2, there was a decrease in FA and ALT for acetaminophen plus IP6 compared to 25 control. The explants incubated only with culture media (Ctrl 4h) presented similar 26 histological aspects to those not incubated (Ctrl 0h). Thus, incubation did not interfere 27 with tissue integrity. For the TBARS trial (GE1), there was a difference between the 4h 28 control and acetaminophen, which was smaller for the latter. These findings indicate 29 that there was probably no lipid peroxidation in the explants exposed to 30 acetaminophen. There was a reduction in GSH in the group exposed to IP6. For GE2, 31 there was an increase in the antioxidant capacity (GSH, FRAP and ABTS) of the 32 acetaminophen group compared to the 4h control, IP6 and acetaminophen plus IP6 33 and for the NBT, the difference between the 4h control and acetaminophen, greater for 34 the latter, indicating possible oxidative damage. In the second experiment (E2), the 35 methodology was similar to the first, with the explants subjected to treatments: control 36 0h; control 4h; IP6 (5mM); FB1 (100 µM); FB1 + IP6. There was no difference in the 37 injury score between GE1 and GE2. For GE1 and GE2, treatments IP6 and FB1 + IP6 38 decreased the activity of AF in relation to control and FB1. When IP6 was added to 39 FB1, it reduced the activity of ALT and PT compared to FB1 and the control. For GE1 40 and GE2, FB1 induced an increase in GSH compared to IP6 and control, respectively, 41 while incubation with FB1 + IP6 decreased GSH compared to FB1. The results 42 obtained showed a protective action of IP6. 43 Keywords: Biomarkers. IP6. Morphology. Oxidative stress. Pigs. 44 45 LISTA DE FIGURAS 1 ARTIGO I 2 3 Figura 1 – Efeitos do acetaminofeno e ácido fítico (IP6) em explantes hepáticos de suínos. A. 4 Controle 4 horas. Morfologia hepática normal. HE. Barra 20 m. B. Grupo IP6. Observa-se 5 discreta vacuolização citoplasmática. HE. Barra 20 m. C. Grupo acetaminofeno. Observa-se 6 moderado infiltrado linfocitário periportal. HE. Barra 100 m. D. Grupo IP6+acetaminofeno 7 (GE1). Observa-se discreta desorganização trabecular. HE. Barra 100 m. E. Escore médio de 8 lesão em explantes hepáticos de suínos de terminação (GE1). F. Escore médio de lesão em 9 explantes hepáticos de leitões (GE2).........................................................................................49 10 11 Figura 2 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 12 hepática (GE1). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Peroxidação lipídica e 13 produção de ânion superóxido. A. Substâncias reativas ao ácido tiobárbiturico (TBARS). B. 14 Tetrazólio de nitroazul (NBT)...................................................................................................50 15 16 Figura 3 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 17 hepatica (GE1). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Defesa hepática 18 antioxidante. A. Capacidade de eliminação de radicais livres (ABTS). B. Glutationa reduzida 19 (GSH). C. Potencial de redução do ferro (FRAP)......................................................................51 20 21 Figura 4 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 22 hepatica (GE2). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Peroxidação lipídica e 23 produção de ânion superóxido. A. Substâncias reativas ao ácido tiobárbiturico (TBARS). B. 24 Tetrazólio de nitroazul (NBT)...................................................................................................52 25 26 Figura 5 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 27 hepática (GE2). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Defesa hepática 28 antioxidante. A. Capacidade de eliminação de radicais livres (ABTS). B. Glutationa reduzida 29 (GSH). C. Potencial de redução do ferro (FRAP)......................................................................53 30 31 32 ARTIGO II 33 34 35 Figure 1 - Histological aspects of pigs’ liver explants. A. Control group. Normal aspect of liver. 36 HE. Bar 100 m. B. Phytic acid (IP6) group. Normal aspect of liver. C and D. Fumonisin B1 37 group. Nuclear vacuolization of hepatocytes (thin arrow) (C) and hepatocyte megalocitosis 38 (dotted arrow) (D). HE. Bar 100 m. E. FB1 + IP6. Normal aspect of liver. HE. Bar 100 µm. F. 39 Liver lesion score in finishing pigs (EG1). Morphological score (AU—Arbitrary Units). G. 40 Liver lesion score in piglets (EG2) Morphological score (AU—Arbitrary Units)…………….65 41 42 Figure 2 - Effects of fumonisin (FB1) and phytic acid (IP6) on liver oxidative stress in EG1. 43 Explants exposed to control treatment ( ); IP6 (5mM) ( ); FB1 (100μM) ( ) and FB1 44 (100 µM) plus IP6 (5 mM) ( ). Lipid peroxidation and superoxide anion production. A. 45 Thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS). B. Nitroblue tetrazolium (NBT). Liver 46 antioxidant defense. C. Free-radical scavenging ability (ABTS). D. Ferric reducing ability 1 potential (FRAP). E. Reduced glutathione (GSH)…………………………………...………..66 2 3 Figure 3 - Effects of fumonisin FB1 (FB1) and phytic acid (IP6) on liver oxidative stress in the 4 EG2. Explants exposed to control treatment ( ); IP6 (5mM) ( ); FB1 (100M) ( ) and 5 FB1 (100 µM) + IP6 (5 mM) ( ). Lipid peroxidation and superoxide anion production. A. 6 Thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS). B. Nitroblue tetrazolium (NBT). Liver 7 antioxidant defense. C. Free-radical scavenging ability (ABTS). D. Ferric reducing ability 8 potential (FRAP). E. Reduced glutathione (GSH)…………………………………………….67 9 10 Figure 4 - A. Supernatant harvest for biochemical measurements. B. Collection of liver 11 explants after 4-hours for histopathological processing, in order to verify the different injury 12 scores……………………………………………………………………………………….…72 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 LISTA DE TABELAS 1 ARTIGO I 2 3 Tabela 1 – Efeito do tratamento independentemente do tempo nos parâmetros bioquímicos do 4 sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de suínos de terminação (GE1) expostos ao meio 5 de cultura (Controle); ácido fítico (IP6) e 20 mM de acetaminofeno (Acet)..............................44 6 7 Tabela 2 - Efeito do tratamento independentemente do tempo nos parâmetros bioquímicos do 8 sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de leitões (GE2) expostos ao meio de cultura 9 (Controle); ácido fítico (IP6); 20 mM de acetaminofeno (Acet) e Acet (20mM) mais IP6 10 (5mM).......................................................................................................................................45 11 12 Tabela 3 - Efeito do tratamento dependente do tempo nos parâmetros bioquímicos no 13 sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de suínos de terminação (GE1) expostos ao meio 14 de cultura (Controle); ácido fítico (IP6), 20 mM de acetaminofeno (Acet) e Acet (20mM) mais 15 IP6 (5mM).................................................................................................................................47 16 17 Tabela 4 - Efeito do tratamento independentemente do tempo nos parâmetros bioquímicos do 18 sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de leitões (GE2) expostos ao meio de cultura 19 (Controle); ácido fítico (IP6); 20 mM de acetaminofeno (Acet) e Acet (20mM) mais IP6 20 (5mM).......................................................................................................................................47 21 22 23 ARTIGO II 24 25 Table 1 - Effect of treatment independently of the time on the biochemical parameters in the 26 culture supernatant of hepatic explants of finishing pigs (EG1) exposed to the culture medium 27 (Control - CTRL); 5 mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100M) 28 µM plus IP6 (5mM)...................................................................................................................61 29 30 Table 2 - Effect of treatment independently of the time on the biochemical parameters in the 31 culture supernatant of hepatic explants of piglets (EG2) exposed to the culture medium (Control 32 - CTRL); 5 mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100M) µM plus 33 IP6 (5mM).................................................................................................................................62 34 35 Table 3 - Effect of treatment dependently of the time on the biochemical parameters in the 36 culture supernatant of hepatic explants of finishing pigs (EG1) exposed to the culture medium 37 (Control - CTRL); 5mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100 µM) 38 plus IP6 (5mM)..........................................................................................................................63 39 40 Table 4 - Effect of treatment dependently of the time on the biochemical parameters in the 41 culture supernatant of hepatic explants of piglets (EG2) exposed to the culture medium (Control 42 - CTRL); 5 mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100M) µM plus 43 IP6 (5mM).................................................................................................................................63 44 45 46 47 48 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 1 2 3 ABTS 2, 2– azinobis-3-etil–benzotiazolina-6-ácido sulfônico ALT Alanina aminotransferase AST Aspartato aminotransferase Ctrl Controle DMEN Dulbecco Modified Eagle Medium ERO Espécies reativas de oxigênio FA Fosfatase alcalina FB1 Fumonisina FRAP Poder de redução do ferro GGT Gama glutamiltransferase GSH Glutationa reduzida HE Hematoxilina eosina IP6 Ácido fítico NBT Nitroazul de tetrazólio SFB Soro fetal bovino TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico UI/L Unidade Internacional/Litro M Micromolar mM Milimolar 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 SUMÁRIO 1 2 1 INTRODUÇÃO…………………………………………......…………………………….10 3 2 REFERENCIAL TEÓRICO......................................................................................12 4 2.1 EXPLANTES TECIDUAIS UTILIZADOS NA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL…...…12 5 2.2 MICOTOXINA: Fumonisina B1 (FB1)………………………...………………………….13 6 2.3 ACETAMINOFENO…………………………………………………..…..……….…..... 17 7 2.3.1 N-acetil-p-benzoquinonaimina: o metabólito hepatotóxico............................... 17 8 2.3.2 Hepatotoxicidade.............................................................................................. 18 9 2.4 ENZIMAS DE EXTRAVAZAMENTO..............................................................................19 10 2.4.1 ALT/ TGP (alanina aminotransferase/ transaminase glutâmico pirúvica) ......... 19 11 2.4.2 AST/ TGO (aspartato aminotransferase/ transaminase glutâmico oxalacética).20 12 2.5 ENZIMAS DE INDUÇÃO................................................................................................. 20 13 2.5.1 GGT (-glutamiltransferase)………………………………………………………...20 14 2.5.2 FA (fosfatase alcalina).......................................................................................21 15 2.6 ÁCIDO FÍTICO.................................................................................................................. 21 16 2.7 ESTRESSE OXIDATIVO.................................................................................................. 23 17 3 REFERÊNCIAS...................................................................................................... 26 18 4 HIPÓTESES........................................................................................................... 36 19 5 OBJETIVOS............................................................................................................37 20 5.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................37 21 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................37 22 6 ARTIGO I - Hepatotoxicidade do acetaminofeno em explantes hepáticos de suínos: 23 avaliação dos biomarcadores de integridade celular, sistema biliar, síntese, escore 24 histopatológico e capacidade antioxidante .................................................................38 25 7 ARTIGO II - Effects of the Phytic Acid and Injury Induced by Fumonisin (FB1) in Liver 26 Explants of Piglets and Finishing Pigs: Oxidative Stress, Histological Lesions and 27 Biomarkers................................................................................................................. 58 28 8 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 81 29 ANEXOS.................................................................................................................... 83 30 31 32 33 10 1 INTRODUÇÃO 1 2 Os modelos ex vivo, caracterizam-se pelo cultivo de fragmentos de órgãos que 3 são colhidos e posteriormente incubados em placas com meio de cultura em 4 temperatura semelhante à corpórea, simulando as condições de um organismo vivo. 5 A metodologia dos explantes também proporciona a possibilidade de colher várias 6 amostras de um único doador, aumentando assim a confiabilidade estatística da 7 investigação e reduzindo o número de animais a serem utilizados, concordando com 8 o princípio dos 3 R’s da experimentação animal (Replacement, Reduction e 9 Refinemment) proposto por Russell e Burch em 1959. No entanto, uma das maiores 10 limitações da técnica é o tempo de viabilidade celular devido à hipóxia a qual o tecido 11 é submetido durante o tempo de cultivo (RANDALL et al., 2011). 12 Neste sentido, os suínos são muito utilizados em pesquisas por apresentarem 13 grandes similaridades anatômicas e fisiológicas com o ser humano. O fígado é um 14 órgão que também compartilha dessa similaridade e cada vez mais esta espécie vem 15 sendo utilizada para experimentos laboratoriais e procedimentos com xenobióticos 16 (SIMÕES, 2004; GUILLOTEAU et al., 2010). 17 O fígado é de vital importância para o bom funcionamento do organismo. Este 18 órgão atua no armazenamento e degradação de substâncias, hormônios e participa 19 da síntese e secreção de sais biliares, além de promover a regulação dos 20 carboidratos, proteínas e lipídios. Devido às inúmeras e relevantes funções que 21 desempenha no organismo, foram desenvolvidas várias técnicas para avaliar seu 22 funcionamento, bem como para apontar possíveis lesões neste órgão (GUYTON, 23 1997). 24 Existem fármacos que causam hepatotoxicidade, como o acetaminofeno que é 25 classificado como um anti-inflamatório não esteroidal. Quando este princípio ativo se 26 encontra em concentrações elevadas, ocorre o processo de oxidação no fígado pelo 27 citocromo P450 e com essa metabolização forma-se o N-acetil-p-benzoquinona-imina 28 (NAPQI), que é um metabólito tóxico para o organismo (ANDERSSON, 1990). 29 Além deste fármaco, alimentos estão sujeitos à contaminação por substâncias 30 também hepatotóxicas, cuja ingestão é capaz de causar sérios transtornos ao 31 organismo do homem e dos animais (DILKIN et al., 2010). As micotoxinas são 32 metabólitos secundários produzidos por certos fungos. Os fungos podem crescer em 33 uma variedade de grãos e alimentos, incluindo cereais, frutas secas, maçãs e 34 11 especiarias, geralmente sob condições quentes e úmidas. Assim, quando alimentos 1 contaminados são ingeridos pelo homem e animais, podem provocar uma doença 2 denominada de micotoxicose, devido a exposição crônica com baixas doses (MOSS, 3 1991). 4 Dentre as micotoxinas, as fumonisinas são moléculas estruturalmente 5 relacionadas, sendo que algumas já foram isoladas e caracterizadas. As fumonisinas 6 B1 (FB1) e B2 (FB2) foram isoladas de uma amostra de Fusarium verticillioides, porém 7 outras espécies do gênero Fusarium também são produtoras dessas micotoxinas. A 8 toxicidade de FB1 foi comprovada em algumas espécies animais, ocasionando edema 9 pulmonar em suínos e leucoencefalomalácia em equinos, além de câncer esofágico e 10 hepático em seres humanos (DILKIN et al., 2010). 11 Desta forma, substâncias antioxidantes vem sendo estudadas, como o ácido 12 fítico (IP6) que inibe a formação de radicais livres e é encontrado na maioria dos grãos, 13 sementes e feijões (GHIRETTI, 1997). Além disso, o ácido fítico pode diminuir a 14 incidência de câncer e proteger contra algumas doenças inflamatórias (GRAF, 1990), 15 sendo que esses efeitos protetores foram associados à redução da formação de 16 substâncias derivadas da peroxidação lipídica (DA SILVA, 2014). 17 Portanto, a utilização de um modelo ex vivo hepático suíno busca elucidar a 18 acessibilidade e reprodutibilidade das alterações celulares diante da exposição ao 19 acetaminofeno e FB1, bem como quais são os mecanismos celulares de proteção 20 hepática que surgem a partir da utilização do ácido fítico, minimizando perdas 21 econômicas e riscos à saúde única. 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 12 2 REFERENCIAL TEÓRICO 1 2 O fígado é um órgão localizado na parte mais cranial do abdômen, tem um 3 tamanho médio variável de 1 a 1,5% do peso corpóreo em herbívoros, até 3 a 5% em 4 carnívoros. A sua unidade básica é denominada lóbulo hepático, que é uma estrutura 5 cilíndrica, com comprimento e diâmetro variável em milímetros. Os lóbulos hepáticos 6 estão constituídos por hepatócitos, arteríolas, vênulas e pequenos canalículos biliares, 7 que formam o arcabouço estrutural do fígado (DROUGAS et al., 1996). 8 Embora apresente pequenas diferenças morfológicas, o fígado dos suínos tem 9 um metabolismo semelhante ao dos humanos (SWINDLE; SMITH, 1998). Trabalhos 10 relacionados à hemodinâmica hepática, metabolismo da glicose, lactato e glicerol 11 foram desenvolvidos e validados em suínos (DROUGAS et al., 1996). Estas 12 similaridades entre as espécies são observadas em diversos sistemas orgânicos, 13 como o sistema gastrointestinal (GUILLOTEAU et al., 2010), cardiovascular e 14 pulmonar. O tamanho e a morfologia são próximos ao do ser humano, além da 15 semelhança fisiológica nas áreas de fluxo sanguíneo coronário, crescimento do 16 aparelho cardiovascular, pulmonar e desenvolvimento neonatal. Outros órgãos como 17 a pele e a vesícula biliar dos suínos também são utilizados em modelos experimentais 18 para seres humanos (SWINDLE; SMITH, 1998). Por isto, cada vez mais os suínos têm 19 sido empregados como modelos animais em estudos laboratoriais. 20 21 2.1 EXPLANTES TECIDUAIS NA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL 22 23 24 A reavaliação da utilização de animais nos experimentos é tendência mundial 25 e teve início a partir do surgimento de um programa internacionalmente reconhecido 26 denominado de 3Rs (Reduction, Refinement, Replacement), que objetiva, além de 27 diminuir o número de animais utilizados na pesquisa, minimizar a dor e o desconforto 28 e buscar alternativas para a substituição dos testes in vivo (RUSSEL; BURCH, 1959; 29 BALLS, 1994; FLECKNELL,1994; SCHECHTMAN, 2002). Deste modo, em busca de 30 alternativa à experimentação in vivo, desde a década de 30, estudos buscam 31 desenvolver técnicas substitutivas, entre estas pode-se destacar o cultivo de 32 explantes modelo ex vivo. Neste modelo experimental, fragmentos de órgãos colhidos 33 por biópsia são incubados em situações que mimetizam as condições do organismo 34 vivo (FELL; ROBISON, 1930; BANSAL et al., 2009; RANDALL; TURTON; FOSTER, 35 13 2011). Ximénez et al. (2017) empregaram um modelo hepático ex vivo humano para 1 avaliar a expressão diferencial de genes patogênicos de Entamoeba histolytica x E. 2 díspar e a interação hospedeiro-parasita (incluindo a resposta imune humana). 3 O emprego da técnica ex vivo mostra um grande potencial no estudo de 4 micotoxinas ou demais agentes tóxicos ao organismo humano e animal (BANSAL et 5 al., 2009; KOLF-CLAUW et al., 2009; RANDALL et al., 2011). O desenvolvimento do 6 modelo busca também atender aos requisitos éticos e legais presentes na 7 normatização (decreto 93.933 aprovado em 1987) do Conselho Nacional de Saúde 8 que determina que todo estudo deve ser planejado de maneira a obter o máximo de 9 informações utilizando-se o menor número de animais (BASSO e BRACARENSE, 10 2013). 11 Os dados da literatura demonstram que o suíno é um modelo animal eficaz em 12 pesquisas, podendo ser amplamente utilizado na busca do conhecimento das 13 afecções que afetam o homem. Esta técnica promissora é adequada para estudos 14 toxicológicos, nutricionais e patológicos, para ambas as espécies (RANDALL et al., 15 2011), porém apresenta algumas limitações como o tempo de incubação do tecido, 16 viabilidade celular e manutenção das condições existentes in vivo, portanto boa parte 17 dos estudos com o modelo de explante busca aprimorar as técnicas de forma a 18 superar as limitações contribuindo em diversos ramos da ciência, com utilização de 19 diferentes tecidos (BASSO; BRACARENSE, 2013). 20 Sendo assim, o propósito do presente trabalho foi realizar abordagem sobre o 21 princípio dos 3Rs, considerando a implantação e validação de métodos alternativos 22 como a utilização de explantes hepáticos, caracterizando lesões e distúrbios 23 funcionais, principalmente aplicados no contexto da toxicidade, avaliando o uso de 24 biomarcadores hepáticos, estresse oxidativo e caracterização histológica. 25 26 2.2 MICOTOXINAS: Fumonisina B1 (FB1) 27 28 29 Micotoxinas são metabólitos secundários de baixo peso molecular, produzidas 30 por fungos em situações de estresse (CAST, 2003). A contaminação de cereais, grãos 31 e alimentos por fungos, é favorecida pelas condições ambientais, sendo que as 32 micotoxinas fumonisina B1 (FB1) e o desoxinivalenol (DON) são as principais 33 encontradas, tanto nas fontes de alimentação humana quanto animal (TARANU et al., 34 2008). Elas também podem ser transportadas em produtos de origem animal, como 35 14 carne, ovos e leite, comprometendo assim a segurança dos consumidores humanos 1 e as concentrações nos alimentos para animais devem ser monitoradas 2 continuamente para apoiar a avaliação de riscos (GRUBER et al., 2019). As 3 micotoxinas não podem ser destruídas pelo processamento comum dos alimentos e 4 com isso a exposição de animais e humanos a estas toxinas é inevitável (MUNKVOLD; 5 DESJARDINS, 1997). 6 A ingestão de micotoxinas pode causar um quadro clínico chamado de 7 micotoxicose, na qual a gravidade vai depender da toxicidade da toxina ingerida como 8 também de outros fatores como: idade, escore físico do indivíduo e o tempo de 9 exposição à substância (BHATNAGAR et al., 2002). O diagnóstico da doença é muito 10 difícil, pois os sinais clínicos nos indivíduos são variados e inespecíficos, como 11 diarreia, hemorragias, imunossupressão ou diminuição da produtividade (KANORA; 12 MAES, 2009). 13 Em animais e humanos, intoxicações podem ter um curso agudo ou crônico. 14 Quando agudo, o quadro está ligado à ingestão de altas doses de toxinas, 15 ocasionando o aparecimento de forma rápida dos sinais clínicos, podendo levar o 16 indivíduo à morte. Por sua vez, a intoxicação crônica, tem a característica de não 17 demonstrar sinais clínicos, no entanto pode trazer prejuízos em parâmetros 18 zootécnicos e causa perdas significativas na produção animal (SANTÚRIO et al., 19 2000; SANTIN et al., 2000). 20 Diferentes linhas de pesquisas descrevem os efeitos das micotoxinas, tanto em 21 humanos como animais (FREIRE et al., 2007; VITORINO, 2011), na qual a espécie 22 suína é considerada uma das mais vulneráveis às intoxicações por fumonisina e 23 desoxinivalenol (MALLMANN; DILKIN, 2007; YAZAR; OMURTAG, 2008). 24 As fumonisinas são um grupo de micotoxinas produzidas de forma significativa 25 principalmente pelos fungos Fusarium verticillioides e Fusarium proliferatum 26 (CREPPY, 2002) que contaminam o milho e seus derivados pelo mundo todo 27 (TURNER; NIKIEMA; WILD, 1999). 28 A infestação de milho com F. verticillioides e a consequente contaminação por 29 fumonisina são facilitadas por altas temperaturas e baixa precipitação em torno da 30 silagem. A casuística de FB1 em alimentos produzidos no Brasil tem alcançando 31 índices próximos a 90% nos mais variados alimentos. A FB1 é a principal 32 representante desse grupo comprometendo sobretudo suínos e aves (RODRIGUEZ-33 15 AMAYA; SABINO, 2002), por sua vez as fumonisinas B2 e B3 aparecem em menores 1 proporções (DILKIN; MALLMAM, 2011). 2 No Brasil, a percentagem de contaminação do milho por FB1 varia dependendo 3 da região e condições climáticas, podendo chegar a 100% (CALDAS; SILVA, 2007). 4 Em humanos, o nível de ingestão tolerável de FB1 é de 2μg/kg de peso/dia 5 (STOCMANN et al., 2008). Não estão bem estabelecidos níveis máximos toleráveis 6 de FB1 para os animais, mas o Comitê de Micotoxinas da Associação Americana de 7 Diagnóstico Laboratorial Veterinário tem recomendado níveis máximos de 5, 10, 50 e 8 50 μg/g de ração para equinos, suínos, bovinos e aves respectivamente (MUNKVOLD; 9 DESJARDINS, 1997). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) 10 determinou por meio da Resolução RDC n°59 (26 de dezembro de 2013) que a partir 11 de janeiro de 2016, prorrogado até 1º de janeiro de 2017, o limite máximo tolerável de 12 FB1 em milho em grão e subprodutos é de 1000-1500 μg/Kg (ANVISA, 2011). 13 A fumonisina gera perdas econômicas na produção animal (DILKIN et al., 14 2004). A intoxicação por FB1 nos animais causa leucoencefalomalácia em equinos e 15 nefrotoxicidade em ovinos (MALLMANN et al., 1999; VOSS et al., 2001), deficiência 16 imunológica e lesões no fígado e nos rins em galinhas (BIANCHI et al., 2005), 17 hepatoxicidade e nefrotoxicidade em bovinos (MATHUR et al., 2001) e câncer 18 hepático e renal em roedores (SCOTT, 1993). 19 Suínos intoxicados com altas doses de FB1 (acima de 100mg/kg/ração) 20 apresentam sinais clínicos de intoxicação aguda geralmente de três a cinco dias após 21 o início de ingestão da ração contaminada (HASCHECK et al., 2001). O quadro clínico 22 caracteriza-se por edema pulmonar, hepatotoxicidade, cardiotoxicidade e lesões 23 pancreáticas (MALLMANN; DILKIN, 2007). Pequenas doses de micotoxinas levam ao 24 aparecimento de lesões hepáticas em leitões desmamados (CASTEEL et al., 1993). 25 Estas alterações podem ser avaliadas por meio do aumento das atividades 26 enzimáticas séricas (CASTEEL et al., 1994). A FB1 é pouco absorvida no trato 27 gastrintestinal, sendo eliminada rapidamente com pouca acumulação no fígado e nos 28 rins (VOSS et al., 2002), entretanto as maiores concentrações são vistas em tais 29 órgãos (PRELUSKY et al., 1996). Esta toxina é resistente ao calor sendo apenas 30 degradada em processos nos quais a temperatura ultrapassa 150°C (KAWASHIMA; 31 SOARES, 2006). 32 Em seres humanos, a ingestão crônica de alimentos contaminados com FB1 foi 33 associada a câncer esofágico (WESTHUIZEN et al., 1999). Em suínos, a intoxicação 34 16 crônica por FB1 ocorre pelo consumo de ração com baixas concentrações da toxina e 1 por um tempo prolongado. Suínos alimentados com ração contaminada na 2 concentração de 6 mg de fumonisina/kg durante cinco semanas apresentaram edema 3 pulmonar e lesões hepáticas como vacuolização e megalocitose (GRENIER et al., 4 2011). Também já foi relatado, letargia, perda de apetite, taquicardia e taquipnéia, 5 após ingestão de alimentos contaminados por doses entre 1 a 20 mg/Kg de FB1 6 (POZZI et al., 2002; DILKIN; MALLMAM, 2011). Fêmeas gestantes podem apresentar 7 aborto e se este não ocorrer, os leitões podem apresentar sinais de edema pulmonar 8 (DILKIN; MALLMAM, 2011). Estes sinais variam conforme a concentração da 9 micotoxina ingerida, sexo, idade e tempo de consumo (HASCHEK et al., 1992; POZZI 10 et al., 2002). 11 A morte de suíno intoxicado ocorre normalmente poucas horas após o início da 12 apresentação destes sinais. Na necropsia, pode ser observado edema pulmonar, 13 hidrotórax, icterícia, fígado escurecido e firme. Doses baixas induzem degeneração 14 hepática progressiva, enquanto doses mais altas causam edema pulmonar 15 (OSWEILER et al., 1992). 16 A intoxicação crônica com fumonisina em suínos está associada a elevação da 17 atividade de fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase e gamaglutamil 18 transferase (KANEKO, 1997). Observa-se também aumento dos níveis sanguíneos 19 de colesterol e de bilirrubina (OSWEILER et al., 1992; MOTELIN et al., 1994). 20 O mecanismo de ação das fumonisinas ainda não é perfeitamente conhecido, 21 todavia Wang et al. (1991) propuseram que a FB1 poderia intervir na biossíntese de 22 esfingolipídios ou “turnover” de esfingosina, porque existe uma similaridade da 23 molécula de FB1 com o complexo amino álcool esfingosina, que é um dos trinta ou 24 mais amino álcoois da cadeia longa encontrados nos esfingolipídios de várias 25 espécies. Os esfingolipídios mais abundantes dos tecidos animais são a esfingosina 26 e os glicoesfingolipídeos. A inibição de biossíntese dos esfingolipídios pode ter um 27 profundo efeito sobre a célula, uma vez que esses componentes têm papel importante 28 na estrutura da membrana, comunicação celular, interação intracelular e matriz 29 celular, regulação de fatores de crescimento, como mensageiro de vários fatores, 30 incluindo fator de necrose tumoral, interleucina 1 e fator de crescimento de nervos 31 (MERRILL et al., 1993). FB1 inibe a fagocitose e a biossíntese de esfingolipídeos nos 32 macrófagos pulmonares, induzindo um acúmulo de material membranoso nas células 33 17 endoteliais dos capilares pulmonares. Essa alteração parece ser específica a esse 1 tipo de célula e a espécie suína (HASCHEK et al., 2001). 2 A inibição dessa via metabólica resulta na depleção do complexo esfingolipídio 3 e no aumento intracelular da concentração de esfinganina e esfingosina, as quais na 4 célula podem desencadear sinais pró-apoptóticos, citotóxicos e imunotóxicos. Além 5 disso, quando acumuladas no meio intracelular, esses compostos deixam a célula e 6 aparecem no sangue periférico (WANG et al., 1992) e na urina (RILLEY et al., 1994; 7 WANG et al., 1999). Assim, a elevação das bases esfingoides em urina, soro e tecidos 8 pode ser usada como biomarcador na exposição às fumonisinas (RILLEY et al., 1994). 9 O estresse oxidativo estimulado por FB1 pode perturbar a capacidade 10 antioxidante celular e a transdução das vias de sinais para células alvo, por aumento 11 da produção de espécies de oxigênio (ERO) e peroxidação lipídica (STOCKMANN-12 JUVALA, et al. 2004). 13 14 2.3 ACETAMINOFENO 15 16 17 O acetaminofeno conhecido também como paracetamol é um fármaco com 18 ação analgésica e antipirética. Metabolizado pelo fígado, mais especificamente no 19 retículo endoplasmático liso dos hepatócitos (DAHLIN, 1984). Sua ligação com 20 proteínas plasmáticas é de 10% a 30%, podendo chegar a 50% em casos de 21 sobredose. Apresenta capacidade de atravessar a barreira placentária e hemato-22 encefálica (SEBBEN et al., 2010) e sua eliminação é renal. 23 24 2.3.1 N-acetil-p-benzoquinonaimina: o metabólito hepatotóxico 25 26 A principal via de metabolização do paracetamol é a hepática, a qual ocorre por 27 meio de três mecanismos metabólicos: conjugação com ácido glicurônico 28 (glicuronidação), sulfatação e oxidação. A via oxidativa produz um metabólito 29 altamente tóxico, que em condições terapêuticas, se une a glutationa, formando 30 conjugados de cisteína e ácido mercaptúrico. Enquanto a glicuronidação e a 31 sulfatação produzem metabólitos atóxicos (SEBBEN et al., 2010). 32 Em doses acima de 4 g/dia, após a saturação das vias metabólicas principais, 33 o paracetamol sofre oxidação, gerando o metabólito tóxico n-acetil-p-34 benzoquinonaimina (NAPQI) (HE et al., 2011). 35 18 2.3.2 Hepatotoxicidade 1 2 O acetaminofeno é considerado hepatotóxico em doses altas e pode promover 3 lesão hepatocelular (JUNIOR, 2011). A alteração característica é o aumento da 4 atividade das enzimas ALT e AST (transaminases hepáticas). O período de 72 horas 5 a cinco dias é de máxima expressão da hepatotoxicidade, podendo evoluir para 6 falência hepática aguda (SEBBEN et al., 2010). 7 Quando se encontra em concentrações elevadas, o princípio ativo passa a 8 sofrer o processo de oxidação mais importante do fígado pelo citocromo P450 e essa 9 metabolização resulta na formação do N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), que é 10 um metabólito tóxico para o organismo (ANDERSSON, 1990). Entretanto, o 11 organismo tenta compensar esse desbalanço e conjuga esse metabólito com a 12 glutationa, porém um dos principais motivos da intoxicação é a diminuição significativa 13 da glutationa, ocorrendo a saturação dessa via (MAZRAATI, 2018). Por consequência, 14 o NAPQI pode reagir com as macromoléculas celulares do fígado causando lesões 15 por meio do estresse oxidativo (CHAN et al., 2018). 16 Para diagnosticar a intoxicação e/ou exposição por acetaminofeno, podem ser 17 feitos diversos exames complementares, como a dosagem sérica deste príncipio ativo, 18 na qual a obtenção da amostra deve ser 4 horas após a administração; transaminases, 19 nas quais a atividade sérica de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato 20 aminotransferase (AST) se elevam após a administração de acetaminofeno. Pode-se 21 ainda mensurar bilirrubina, albumina (que diminue e permanece baixa durante a 22 falência hepática), glicemia, amilase e coagulograma (SEBBEN et al., 2010; HE et al., 23 2011). A característica bioquímica mais relevante da toxicidade por acetaminofeno é 24 a alta atividade das aminotransferases (MAZRAATI, 2018). 25 26 2.4 ENZIMAS DE EXTRAVAZAMENTO 27 28 29 Para Thrall et al. (2015), os exames laboratoriais hepáticos podem ser divididos 30 em testes que mensuram lesão nos hepatócitos, que detectam colestase e por fim os 31 que avaliam a função hepática. As lesões nos hepatócitos são detectadas por meio 32 da mensuração de enzimas séricas liberadas após ruptura celular hepática, 33 fornecendo informações da extensão, magnitude e curso (aguda ou crônica) da lesão. 34 19 A liberação destas enzimas pode ocorrer também por necrose e alteração na 1 permeabilidade (reações inflamatórias e degeneração celular). 2 Os testes convencionais para avaliação hepática fornecem informações sobre 3 a integridade do hepatócito (ALT, AST e SDH) e integridade do sistema biliar (FA e 4 GGT). A função hepática pode ser avaliada testando a capacidade excretora do fígado 5 (ácidos biliares e bilirrubina) e função de síntese (NH3/ureia, albumina, fibrinogênio, 6 protrombina entre outros) (KANEKO, 1997). 7 8 2.4.1 ALT/ TGP (alanina aminotransferase/ transaminase glutâmico pirúvica) 9 10 ALT é uma enzima encontrada livre no citoplasma dos hepatócitos, então no 11 rompimento e alteração da permeabilidade celular ela é liberada na corrente 12 circulatória sanguínea (THRALL et al., 2015). Esta enzima catalisa a reação de 13 transaminação reversível de alanina e -cetoglutarato em piruvato e glutamato, e 14 utiliza como cofator o piridoxal-fosfato. Os cães e gatos apresentam maiores 15 concentrações desta enzima que as demais espécies, mas não necessariamente ela 16 é uma enzima hepato-específica, pois também pode ser encontrada no músculo 17 estriado esquelético e cardíaco, rins e eritrócitos (GONZALEZ; SILVA, 2006). 18 A atividade da ALT é baixa no citoplasma dos hepatócitos de equinos, suínos 19 e ruminantes para ter valor diagnóstico, não sendo desta forma uma prova confiável 20 para estas espécies (KANEKO, 1997). 21 Várias condições como hipóxia, acúmulo de lipídios hepáticos, doenças 22 bacterianas e virais, inflamações, neoplasias hepáticas, endo e exotoxinas, bem como 23 medicamentos podem induzir a lesão hetatocelular e a consequente aumento da 24 atividade enzimática de ALT no sangue dos cães e gatos. ALT é uma enzima que tem 25 curso de elevação agudo, mas sua elevação pode ser relacionada à lesão encontrada, 26 tendo seu pico de liberação detectado de 3 a 4 dias após a lesão, mas com retorno 27 basal em até 14 dias (GONZALEZ; SILVA, 2006). Segundo Thrall et al. (2015), ALT 28 tem uma meia vida estimada de 17 a 60 horas em cães e de 3,5 horas em gatos. Em 29 animais com lesões crônicas pode haver um discreto aumento desta enzima, o que 30 pode ser quase imperceptível. 31 32 20 2.4.2 AST/ TGO (aspartato aminotransferase/ transaminase glutâmico oxalacética) 1 2 AST promove a catalisação de transaminação reversível de aspartato e -3 cetoglutarato em oxalacetato e glutamato e tem como cofator piridoxal-fosfato. É 4 encontrada predominantemente no citoplasma e nas mitocôndrias dos hepatócitos, e 5 nas células musculares esqueléticas e cardíacas de todas as espécies domésticas 6 (GONZALEZ; SILVA, 2006). 7 A atividade enzimática de AST podem ser induzidos por várias alterações, 8 semelhantes as citadas para elevação de ALT (hipóxia, infecções, inflamações, 9 neoplasias), sendo que pode ocorrer aumento em exercício intenso e em deficiência 10 de vitamina E e selênio (THRALL et al., 2015). 11 12 2.5 ENZIMAS DE INDUÇÃO 13 14 15 Durante a colestase o fluxo biliar fica comprometido de forma parcial ou total, 16 no decorrer deste processo as células biliares liberam algumas enzimas que podem 17 ser detectadas na corrente circulatória. 18 19 2.5.1 GGT (-glutamiltransferase) 20 21 A GGT é uma enzima que tem papel de catalisar a transferência de grupos 22 gamacarboxila do glutamato a um peptídeo, sendo ele geralmente o dipeptídeo Gly-23 Gly, podendo ser encontrada nas membranas e no citosol de células, especialmente 24 no epitélio dos ductos biliares e túbulos renais (GONZALEZ; SILVA, 2006). De acordo 25 com Thrall et al. (2015), GGT é uma enzima que pode estar elevada em lesão hepática 26 aguda, e pode ser encontrada na maioria dos tecidos corporais, dentre eles, no 27 pâncreas, células tubulares renais e glândula mamária de cadelas, ovelhas e vacas. 28 Porém, as enzimas que estão presentes no plasma sanguíneo, geralmente têm 29 origem hepática, devido a maior concentração nos ductos biliares. 30 31 21 2.5.2 FA (fosfatase alcalina) 1 2 De acordo com González e Silva (2006), a FA promove a catalisação da 3 hidrólise de ésteres do ácido fosfórico sob condições alcalinas, tendo um pH de ótima 4 atividade in vitro em torno de 10, existindo isoenzimas de FA na membrana celular de 5 vários tecidos. Os órgãos como fígado, rins, intestinos, pâncreas, ossos e a placenta, 6 tem maiores concentrações de FA nas membranas celulares; são duas formas de 7 isoenzimas produzidas a partir de dois genes diferentes, uma intestinal e uma tecidual 8 inespecífica, esta última pode sofrer alteração pós-translacional adicional nos 9 diferentes tecidos, formando diferentes isoformas nos ossos, rins, placenta e fígado. 10 Também de acordo com os mesmos autores, a maior parte de FA sérica é de origem 11 hepática, devido à isoenzima estar presente nas células do epitélio biliar e nas 12 membranas dos canalículos biliares. 13 14 2.6 ÁCIDO FÍTICO 15 16 17 O ácido fítico (IP6) é um antioxidante presente naturalmente em cereais, 18 leguminosas, nozes, sementes oleaginosas e pólen, compondo cerca de 1-5 % de 19 peso, sendo responsável por 60-90 % do fósforo total de sementes (LOLAS; 20 PALAMIDIS; MARKAKIS, 1976; GRAF; EATON, 1990). É encontrado naturalmente na 21 forma de sais, como fitato de Na2Mg5, K2Mg5 e Ca2Mg5 (PLAAMI, 1997), é inerte e 22 muito estável, podendo ser estocado em solução alcalina ou neutra a 5°C por vários 23 meses (GRAF e EATON, 1990). 24 Sua estrutura química é composta por seis grupos de fosfato ligados a um 25 anel de inositol e quando todos os seis carbonos estão aderidos aos grupos fosfatos, 26 é conhecido como inositol hexafosfato (ácido fítico, IP6, InsP6, inositol hexafostato ou 27 mio-inositol-1,2,3,4,5,6- hexafosfato). O agrupamento dos fosfatos nas posições 1, 2 28 e 3 (axial-equatorial-axial) é único no IP6, cuja estrutura é responsável pela interação 29 específica com o ferro, inibindo sua habilidade em catalisar a formação de radicais 30 hidroxila (reação de Fenton), tornando o IP6 um antioxidante fisiológico potente 31 (VUCENIK e SHAMSUDDIN, 2006). 32 A enzima fitase é indispensável para que ocorra a hidrólise e liberação do 33 fósforo da molécula de fitato (VATS; BANERJEE, 2004). Estas enzimas são 34 22 largamente disseminadas na natureza e podem ser encontradas nas plantas, nos 1 animais e nos micro-organismos (PACHECO, 2010). 2 Existem três nomenclaturas que são utilizadas para denominar o substrato da 3 fitase, são eles: ácido fítico, fitato e fitin (SELLE; RAVINDRAN, 2007). 4 Quando formuladas, as rações de aves e suínos possuem o fornecimento 5 insuficiente de fósforo disponível pelas fontes de origem vegetal para suprir as 6 exigências nutricionais de maneira que o desempenho seja desejável, assim há a 7 necessidade de suplementação com fontes inorgânicas de fósforo (ROSTAGNO; 8 SILVA, 1998). 9 Fitases possuem não só o papel de poupar a retirada de fósforo no ambiente, 10 como de diminuir a capacidade poluente dos dejetos dos animais, tendo em 11 consideração que este mineral poderá ser absorvido a nível intestinal, evitando assim 12 a sua disseminação no solo e em fontes hídricas, fato que poderia acarretar em 13 impactos ambientais (FREITAS et al., 2013). 14 Na maioria das vezes os fitatos são solúveis em meio ácido e quase 15 completamente insolúveis em meios alcalinos. A junção de fitatos à minerais leva à 16 formação de complexos que se precipitam no intestino (duodeno) (JONGBLOED et 17 al., 1993). Na espécie suína, os complexos se desenvolvem no ambiente ácido do 18 estômago (KIES et al., 2006). 19 Quando presente na dieta, o ácido fítico pode causar o desenvolvimento desses 20 complexos com diversos nutrientes, principalmente com o ferro, fazendo com que este 21 mineral fique menos disponível para a absorção (LINDER, 1991). Esta característica 22 do ácido fítico em formar um quelato com o ferro, deixando-o inativo, proporciona uma 23 função antioxidante, inibindo a oxidação com formação de radicais hidroxila (EMPSON 24 et al., 1991). 25 Esta ação antioxidante do ácido fítico foi constatado por diversos 26 pesquisadores, especialmente em carnes e modelos de conservação de produtos 27 (LEE; HENDRICKS, 1995; STODOLAK et al., 2007; FILGUEIRAS et al., 2009). 28 Os efeitos protetivos do IP6 em diferentes doenças estão relacionados à sua 29 ação antioxidante pela quelação com o ferro, supressão da formação de radicais livres 30 de oxigênio e quelação com Ca2+. Estudos evidenciaram sua ação em inibir a 31 peroxidação lipídica no cólon de suínos (PORRES et al., 1999), afetando a atividade 32 da glutationa peroxidase e da catalase. Além disso, o IP6 modula as funções do 33 sistema imune, aumentando a atividade das células natural killer, regulando a ação 34 23 dos neutrófilos e diminuindo a expressão de citocinas e interleucinas pró-inflamatórias 1 (CHOLEWA et al., 2008). Além disso, inibição de agregação plaquetária (VUCENIK, 2 et al. 1999), redução de lipídios (ONOMI; OKAZAKI; KATAYAMA, 2004), prevenção 3 de doenças cardiovasculares (GRASES et al, 2006), bem como um efeito protetor nas 4 doenças neurodegenerativas (ANEKONDA et al., 2011). Em estudos in vitro (KAPRAL 5 et al., 2012) e em modelos animais in vivo (KHATIWADA et al., 2011) descreveram 6 uma diminuição do desenvolvimento de vários tipos de câncer. Estudos prévios ex 7 vivo (SILVA et al., 2014) demonstraram efeitos protetores do IP6 sobre as alterações 8 morfológicas induzidas pelas micotoxinas no intestino. 9 10 2.7 ESTRESSE OXIDATIVO 11 12 13 O organismo possui um complexo sistema de proteção antioxidante, como 14 mecanismo de defesa contra os radicais livres, que são formados constantemente no 15 metabolismo celular normal e em vários eventos patológicos e, quando em excesso, 16 podem ocasionar a oxidação de moléculas biológicas. O desequilíbrio entre o desafio 17 oxidativo e a capacidade de defesa antioxidante do organismo é denominado de 18 estresse oxidativo (MACHADO et al., 2009). 19 Com o metabolismo do oxigênio e nitrogênio várias moléculas tóxicas, 20 conhecidas como espécies reativas são produzidas (BARREIROS et al., 2006). 21 Qualquer organismo que utilize o oxigênio ou nitrogênio durante a respiração celular 22 na quebra de aminoácidos da dieta para obtenção de energia, estão passíveis de se 23 encontrar em estresse oxidativo (FERREIRA; ABREU, 2007). A produção de espécies 24 reativas de oxigênio (ERO) está elevada nas lesões teciduais causadas por traumas, 25 infecções, parasitas, radiações, hipóxia, toxinas e exercícios extremos sendo que 26 trabalhos demonstram que a ação dessas espécies na homeostase celular pode ser 27 primária ou secundária ao desenvolvimento de enfermidades devido ao efeito 28 cumulativo das lesões celulares produzidas nessas condições (CURTIS,2013; SILVA 29 et al., 2013; RUSSO; BRACARENSE, 2016). 30 Existem no organismo, alguns mecanismos para a proteção contra essas 31 substâncias, porém, em algumas condições esses mecanismos não são suficientes e 32 acabam ocasionando danos em tecidos (DA SILVA, 2014). Em pequena quantidade 33 são benéficos e algumas vezes indispensáveis, contudo, em altas concentrações 34 podem ser tóxicos, sobretudo ao oxidarem moléculas biológicas alterando suas 35 24 características e provocando transtornos no metabolismo celular (CHIHUAILAF et al., 1 2002). O excesso de radicais livres no organismo é combatido pelos antioxidantes 2 produzidos pelo corpo ou absorvidos na dieta (BARREIROS et al., 2006; CAMPOS; 3 LEME, 2018) e podem ser definidos como qualquer substância que, quando presente 4 em baixa concentração comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou 5 previne significativamente a sua oxidação (HALLIWELL et al., 2000). 6 Vários métodos foram desenvolvidos para avaliar o dano oxidativo celular, 7 formação de espécies radicais e mecanismos antioxidantes intracelulares. A maioria 8 dos ensaios utilizados avalia o estresse oxidativo e envolve a medição de glutationa 9 reduzida (GSH) e peroxidação lipídica [nível de malondialdeído (MDA)] (SCHAFER; 10 BUETTER, 2001; VASCONCELOS et al, 2007). Para aferição indireta das ERMO 11 (espécies reativas ao metabolismo do oxigênio) e, consequentemente, das lesões 12 oxidativas são os espectrofotométricos e cromatométricos, que medem a atividade 13 enzimática de superóxido desmutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GSH-14 Px) e glutationa redutase (GSH-Rd) e/ou a concentração de tripeptídeos (GSH, 15 GSSG) e aldeídos (MDA). Estas medidas podem ser realizadas em tecidos, sangue e 16 outros fluidos. A lipoperoxidação de membranas é habitualmente monitorada pelo 17 método do MDA (malonaldeído), conhecido como TBARS (substâncias reativas ao 18 ácido tiobarbitúrico) (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; VASCONCELOS et al., 2007). 19 O ensaio FRAP ("Ferric-Reducing Ability of Plasma") testa a força 20 antioxidante baseada no fato de que a habilidade de um composto em produzir Fe2+ a 21 partir de Fe3+ define sua força antioxidante e o ensaio TEAC ("Trolox Equivalent 22 Antioxidant Capacity") ou teste do ABTS baseia-se na inibição por antioxidantes do 23 cátion radical 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de diamônio) que 24 apresenta absorbância característica primária em 415 nm e absorções secundárias 25 em 660, 734 e 820 nm (RE et al., 1999; PRIOR et al., 2003). 26 A determinação dessas substâncias revela-se de grande importância, pois o 27 entendimento dos mecanismos utilizados pelas células para a manutenção do balanço 28 redox do meio é fundamental na identificação de biomarcadores representativos para 29 a avaliação do nível de estresse oxidativo de diferentes indivíduos. Nessa perspectiva, 30 pesquisas aliando esses marcadores e novos desenvolvimentos de ferramentas e 31 métodos analíticos que possibilitem uma avaliação de forma menos invasiva, sensível, 32 rápida e simples, com janelas de detecção cada vez menores, vêm assumindo um 33 papel relevante no avanço da investigação. A intoxicação por fumonisina em suínos e 34 25 a utilização de altas doses de acetaminofeno podem comprometer a funcionalidade 1 do fígado devido a hepatotoxicidade. A utilização de técnicas laboratoriais como o 2 modelo ex vivo permite elucidar os mecanismos de ação dessas substâncias sob o 3 organismo, auxiliando na normatização de limites máximos e na prevenção das 4 intoxicações e lesões. 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 26 3 REFERÊNCIAS 1 2 AMARAL, S.S.; OLIVEIRA, A.G.; MARQUES, P.E.; QUINTÃO, J.L.; PIRES, D.A.; 3 RESENDE, R.R.; SOUSA, B.R.; MELGAÇO, J.G.; PINTO, M.A.; RUSSO, R.C.; 4 GOMES, A.K.; ANDRADE, L.M.; ZANIN, R.F.; PEREIRA, R.V.; BONORINO, C.; 5 SORIANI, F.M.; LIMA, C.X.; CARA, D.C.; TEIXEIRA, M.M.; LEITE, M.F.; MENEZES, 6 G.B. Altered responsiveness to extracellular ATP enhances acetaminophen 7 hepatotoxicity. Cell Communication Signalling, v.11, n.10, 2013. 8 9 ANDERSSON, B. S. et al. N-acetyl-p-benzoquinone imine-induced changes in the 10 energy metabolism in hepatocytes. Chemico-Biological Interactions, v.75, n.2, p. 11 201-211, 1990. 12 13 ANEKONDA, T, S.; WADSWORTH, T.L.; SABIN, R.; FRAHLER, K.; HARRIS, C.; 14 PETRIKOL, B.; RALLE, M.; WOLTJER, R.; QUINN, J. F. Phytic acid as a potential 15 treatment for Alzheimer’s pathology: evidence from animal and in vitro models. 16 Journal of Alzheimers Diseases, v. 23, n.1, p. 21-35, 2011. 17 18 ANVISA. Resolução RCD n°59 (26 de dezembro de 2013). Disponível: 19 http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2011/res0007_18_02_2011_rep.ht20 ml. Acessado em: 15 de janeiro de 2020. 21 22 BALLS, M. Replacement of animal procedures: alternatives in research, education and 23 testing. Laboratory Animals, v. 28, p. 193-211, 1994. 24 25 BANSAL, D.; AVE, P.; KERNEIS, S.; FRILEUX, P.; BOCHE, O.; BAGLIN, A. C.; 26 DUBOST, G.; LEGUERN, A. S.; PREVOST, M. C.; BRACHA, R.; MIRELMAN, D.; 27 GUILLE, N. N.; LABRUYE, R.E. An ex-vivo human intestinal model to study 28 Entamoeba histolytic pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases, New York, 29 v. 3, n. 11, p. 1-11, 2009. 30 31 BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P. Estresse oxidativo: relação entre 32 gerações de espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, v. 29, n. 1, p. 33 113-123, 2006. 34 35 BASSO, K.M.; BRACARENSE, A.P.F.R.L. Tissue explants: a model rediscovered in 36 animal experiments. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 34, n. 6, suplemento 2, 37 p. 3951-3958, 2013. 38 39 BHATNAGAR, D.; YU, J.; EHRLICH, K.C. Toxins in filamentus fungi. In:___ 40 BREITENBACH, M.; CRAMERI, R.; LEHRER, S.B (Eds.). Fungal Allergy and 41 Pathogenicity. Chemical Immunology, v.81, p.167-206, 2002. 42 43 BIANCHI, M.D.; OLIVEIRA, C.A.F; ALBUQUERQUE, R.; GUERRA, J.L.; CORREA, B. 44 Effects of prolonged oral administration of aflatoxin B1 and Fumonisin B1 in broiler 45 chickens. Poultry Science, v. 84, p. 1835-1840, 2005. 46 27 BRUNS, D. H.; ARTWOHL, J.; BROELSCH, C.; KREMER, B. Acetaminophen-induced 1 acute hepatic failure in pigs: controversical results to other animal models. Research 2 in Experimental Medicine, Berlim, v.188, n. p.463–472, 1988. 3 4 CALDAS, E. D.; SILVA, A. C. S. Mycotoxins in corn-based food products consumed in 5 Brazil: an exposure assessment for fumonisins. Journal of Agriculture Food 6 Chemical, v. 55, p. 7974–7980, 2007. 7 8 CAMPOS, M. T.; LEME, F. O. P. Estresse oxidativo: fisiopatogenia e diagnóstico 9 laboratorial. Pubvet, Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 12, n. 1, p. 1-8, 2018. 10 11 CAST, Council of Agricultural Science and Technology Mycotoxins: Risks in plant, 12 animal, and human systems. Task Force Report, n.139, 199 p, 2003. 13 14 CASTEEL, S.W.; TURK, J.R.; COWART, RP, ROTTINGHAUS, G.E. Chronic toxicity 15 of fumonisin in weanling pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 16 Davis, v.5, n, p.413-417, 1993. 17 18 CASTEEL, S.W.; TURK, J.R.; ROTTINGHAUS, G.E. Chronic effects of dietary 19 fumonisin on the heart and pulmonar vasculature of swine. Fundamental and Applied 20 Toxicology, Orlando, v.23, n. p.518-524, 1994. 21 22 CHAN, C. Y. et al. Reactive Metabolite-induced Protein Glutathionylation: a Potentially 23 Novel Mechanism Underlying Acetaminophen Hepatotoxicity. Molecular & Cellular 24 Proteomics, v.17, n.8, p. 1-57, 2018. 25 26 CHIHUAILAF, R.H.; CONTRERAS, P.A.; WITTWER, F.G. Pathogenesis of oxidative 27 stress: consequences and evaluation in animal health. Veterinary Mexico, México, 28 v.33, p.265-283, 2002. 29 30 CHOLEWA, K. et al. The influence of phytic acid on TNF-alpha and it receptor genes 31 expression in colon cancer Caco-2 cells. Acta Polonia e Pharmaceutica, v. 65, p. 75-32 79, 2008. 33 34 CREPPY, E.E. Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe. 35 Toxicology Letters, v. 127, n. p. 19-28, 2002. 36 37 CURTIS, A. O. Parâmetro de estresse oxidativo em cães naturalmente infectados 38 pelo vírus da cinomose. Medicina Veterinária. Universidade Federal de Santa Maria, 39 Santa Maria – Rio Grande do Sul. 2013. 40 41 DA SILVA, E.O.; GEREZ, J.R.; DRAPE, T.C.; BRACARENSE, A.P.F.R.L. Phytic acid 42 decreases desoxynivalenol and fumonisin B1-induced changes on swine jejunal 43 explants. Toxicology Reports, v.1, n.1, p. 284-292, 2014. 44 45 DAHLIN D.C. et al. N-Acetyl-p-benzoquinone imine; a cytochrome P-450-mediated 46 oxidation product of acetaminophen. Proceedings of the National Academy of 47 Sciences USA, v. 81, n. 5, p.1327-133, 1984. 48 28 DILKIN, P.; HASSEGAWA, R.; REIS, T. A.; MALLMANN, C. A.; CORRÊA, B. 1 Intoxicação experimental de suínos por fumonisinas. Ciência Rural, Santa Maria, v. 2 34, n. 1, p. 175-181, 2004. 3 4 DILKIN, P.; DIREITO, G.; SIMAS, M.M.S.; MALLMANN, C.A.; CORRÊA, B. 5 Toxicokinetics and toxicological effects of single oral dose of fumonisina B1 containing 6 Fusarium verticillioides culture material in weaned piglets. Chemico-Biological 7 Interactions, v. 185, p.157-16, 2010. 8 9 DILKIN, P.; MALLMANN, C. A. Mycotoxin and mycotoxicosis in swine. Tradução de 10 Gabriela Zaviezo M. A. Lamic. 183p. 2011. 11 12 DROUGAS, J. G.; BERNARD, S. E.; WRIGHT, J. K.; SIKA, M.; LOPEZ, R. R.; 13 STOKES, K. A.; WILLIANS, P. E.; PINSON, C. W. A model for the extended studies of 14 hepatic hemodynamics and metabolism in swine. Laboratory Animal Science, Braga, 15 v. 46, n. 6, p. 648- 655, 1996. 16 17 EMPSON, K. L.; LABUZA, T. P.; GRAF, E.; Journal Food Science, p.56, 560, 1991. 18 19 FELL, H. B.; ROBISON, R. The development and phosphatase activity in vivo and in 20 vitro of the mandibular skeletal tissue of the embryonic fowl. Biochemical Journal, 21 Londres, v. 24, n. 6, p. 1905-1921, 1930. 22 23 FERREIRA, A.L.A.; MATSUBARA, L.S. Radicais livres: conceitos, doenças 24 relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação 25 Médica Brasileira, v.43, n.1, 1997. 26 27 FERREIRA, I. C. F. R.; ABREU, R. Estresse oxidativo, antioxidantes e fitoquímicos, 28 Bioanálise, n.1, p.32-39, 2007. 29 30 FILGUEIRAS, C. T.; CASAGRANDE, R.; SOARES, A. L., SHIMOKOMAKI, M.; IDA, E. 31 I. Avaliação da atividade antioxidante do ácido fítico de germe de milho. Química 32 Nova, v.32, n.7, p.1787-1791, 2009. 33 34 FLECKNELL, P.A. Refinement of animal use – assessment and alleviation of pain and 35 distress. Laboratory Animals, v. 28, p. 222-231, 1994. 36 37 FREIRE, F. C. O.; VIEIRA, I. G. P.; GUEDES, M. I. F; MENDES, F. N. P. Micotoxinas: 38 importância na alimentação e na saúde humana e animal. Fortaleza: Embrapa 39 Agroindústria Tropical, 2007. 48 p. (Embrapa Agroindústria Tropical. Documento, 40 110). 41 42 FREITAS, B. V.; KOIYAMA, N. T. G.; LIMA, M. M.SANTOS, M. T. V.; FILARDI, R.S.; 43 ARAÚJO, L. F. Utilização de fitase na dieta de suínos em crescimento: viabilidade 44 técnica e econômica e características ósseas. Anais..Pirassununga: FMVZ-USP, 45 2013. 46 29 GHIRETTI, G. P. et al. Comparative evaluation of some antioxidants in salame Milano 1 and mortadella production. Meat Science, v.47, n. 1-2, p.167-176, 1997. 2 3 GONZALEZ, F.H.D, SILVA, S.C. Introdução à Bioquímica Clínica Veterinária. 2ª 4 ed. Porto Alegre: Editora da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.v. 8, p. 318-5 337, 2006. 6 7 GRAF, E.; EATON, J.W. Antioxidant functions of phytic acid. Free Radical Biology & 8 Medicine, v. 8, n.1, p.61-69, 1990. 9 10 GRASES, F.; SANCHIS, P.; PERELLO, J.; ISERN, B.; PRIETO, R.M.; FERNANDEZ-11 PALOMEQUE, C.; FIOL, M.; BONNIN, O.; TORRES, J.J. Phytate (myo-inositol 12 hexakisphophate) inhibits cardiovascular calcifications in rats. Frontier in Bioscience, 13 v.1, n.11, p.136-142, 2006. 14 15 GRENIER, B.; BRACARENSE, A.P.L.; LUCIOLI, J.; PACHECO, G.D.; COSSALTER, 16 A.M.; MOLL, W.D.; SCHATZMAYR, G.; OSWALD, I.P. Molecular Nutrition and Food 17 Research, v. 55, p. 761-771, 2011. 18 19 GRUBER-DORNINGER, C.; JENKINS, T.; SCHATZMAYR, G. Global mycotoxin 20 occurrence in feed: a ten-year survey. Toxins, v.27, n.7, p. 375, 2019. 21 22 GUILLOTEAU, P.; ZABIELSKI, R.; HAMMON, H. M.; METGES, C. C. Nutritional 23 programming of gastrointestinal tract development. Is the pig a good model for man? 24 Nutrition Research Reviews, Germany, v. 23, n. 1, p. 4-22, 2010. 25 26 GUYTON A. C. Tratado de Fisiologia Médica, 9ª ed., Guanabara Koogan, Rio de 27 Janeiro, c. 70, p. 672, 1997. 28 29 HALLIWELL, B.; CLEMENT, M. V.; LONG, L. H. Hydrogen peroxide in the human 30 body. Febs Letters, v. 486, n. 1, p. 10-13, 2000. 31 32 HASCHEK, W.M., MOTELIN, G., NESS, D.K.; HARLIN, K.S.; VESONDER, R.F.; 33 PETERSON, R. E.; BEASLEY, V. R. Characterization of fumonisin toxicity in orally and 34 intravenously dosed swine. Mycopathology, v.117, n. 1, p. 83-96, 1992. 35 36 HASCHEK, W.M.; GUMPRECHT, L.A., SMITH, G.; TUMBLESON, M.E.; 37 CONSTABLE, P.D. Fumonisin toxicosis in swine: An overview of porcine pulmonary 38 edema and current perspectives. Environmental Health Perspectives, v.109, p. 251-39 257, 2001. 40 41 HE, Y.Y., ZHANG B.X., JIA F.L. Protective effects of 2,4-dihydroxybenzophenone 42 against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. World Journal of 43 Gastroenterology, v. 17, n.21, p.2663-2666, 2011. 44 45 30 JONGBLOED, A.W.; KEMME, P.A.; MROZ, Z. The role of microbial phytases in pig 1 production, In: ENZYMES IN ANIMAL PRODUCTION, 1993, Kartause Ittingen. 2 Proceedings..., Kartause Ittingen, Switzerland, p.173-180,1993. 3 4 JUNIOR E.V.M. Situações que favorecem ou reduzem a hepatotoxicidade pelo 5 acetaminofem. Revista Suplemento Hepatotoxicidade, v.30, n.1, p. 06-47, 2011. 6 7 KANEKO, J.J.; HARVEY, J.W.; BRUSS, M.L. Clinical Biochemistry of Domestic 8 Animals. Academic Press, 1997, 5ª edição, 932 p. 9 KANORA, A.; MAES D. The role of mycotoxins in pig reproduction: a review. 10 Veterinary Medicine, v.54, p. 565-576, 2009. 11 12 KAPRAL, M.; WAWSZCZYK, J., JURZAK, M., HOLLEK, A., WĘGLARZ, L. The effect 13 of inositol six phosphate on the expression of selected metalloproteinases and their 14 tissue inhibitors in IL- 1β-simulated colon cancer cells. International Journal of 15 Colorectal Disease, v.27, n.11, p.1419-1428, 2012. 16 17 KAWASHIMA, L.M.; SOARES, L.M.V. Incidência de fumonisina b1, aflatoxina B1, B2, 18 G1 e G2, ocratoxina A e zearalenona em produtos de milho. Ciência e Tecnologia 19 de Alimentos, v. 26, p. 516-521, 2006. 20 KHATIWADA, J.; VERGHESE, M.; DAVIS, S.; WILLIAMS, L.L. Green tea, phytic acid, 21 and inositol in combination reduced the incidence of azoxymethane-induced colon 22 tumor in fisher 344 male rats. Journal of Medicinal Food, v.14, n.11, p.1313-1320, 23 2011. 24 KIES, A.K.; DE JONGE, L.H.; KEMME, P.A. et al. Interaction between protein, phytate, 25 and microbial phytase. In vitro studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 26 v.54, p.1753—1758, 2006. 27 28 KOLF-CLAUW, M.; CASTELLOTE, J.; JOLY, B.; BOURGES-ABELLA, N.; 29 RAYMOND-LETRON, I.; PINTON, P.; OSWALD, I. P. Development of a pig jejunal 30 explant culture for studying the gastrointestinal toxicity of the mycotoxin 31 deoxynivalenol: histopathological analysis. Toxicology in Vitro, v.23, n.8, p. 1580-32 1584, 2009. 33 34 LEE, B.J.; HENDRICKS, D.G. Phytic acid protective effect against beef round muscle 35 lipid peroxidation. Journal of Food Science, v. 60, n. 2, p. 241-244, 1995. 36 37 LINDER, M.C. Nutrition and metabolism of the trace elements. In: LINDER, M.C. 38 Nutritional biochemistry and metabolism with clinical applications. 2ª Ed.. New York: 39 Elsevier Science, Cap.7, p. 215-276, 1991. 40 41 LOLAS, G.M.; PALAMIDIS, N.; MARKAKIS, P. The phytic acid-total phosphorus 42 relation in barley, oats, soybeans and wheat. Cereal Chemistry Journal, v.53, n.6, 43 p.867- 871, 1976. 44 45 31 MACHADO, L. P.; KOHAYAGAWA, A.; SAITO, M. E.; SILVEIRA, V.F. da; 1 YONEZAWA, L. A. Lesão oxidativa eritrocitária e mecanismos antioxidantes de 2 interesse em Medicina Veterinária. Revista de Ciências Agroveterinárias, v. 8, n. 1, 3 p. 84-94, 2009. 4 5 MALLMANN, C.A.; SANTURIO, J.M.; DILKIN, P. Equine leukoencephalomalacia 6 associated with ingestion of corn contaminated with fumonisin B1. Revista de 7 Microbiologia, v.30, n.3, p. 249-252,1999. 8 9 MALLMANN, C. A.; DILKIN, P. Micotoxicoses. IN: SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, 10 D. (Ed). Doenças dos Suínos. Goiânia: Cânone editorial, p. 487- 509, 2007. 11 12 MATHUR, S.; CONSTABLE, P. D.; EPPLEY, R. M.; WAGGONER, A. L.; 13 TUMBLESON, M. E.; HASCHER, W. M. Fumonisin B1 is hepatotoxic and nephrotoxic 14 in milk-fed calves. Toxicology Science, v.60, p. 385-396, 2001. 15 16 MAZRAATI, P.; MINAIYAN, M. “Hepatoprotective Effect of Metadoxine on 17 Acetaminophen-Induced Liver Toxicity in Mice”. Advanced Biomedical Research, 18 v. 7, n.67, 2018. 19 20 MERRILL, A.H., VAN ECHTEN, G., WANG, E.; SANDHOFF, K. Fumonisin B1 inhibits 21 sphingosine (sphinganine) N - acyltransferase and de novo sphingolipid biosynthesis 22 in cultured neuron in situ. Journal of Biological Chemistry, v.268, p.2299-2306, 23 1993. 24 25 MOSS, M.O. Economic importance of mycotoxins-recent incidence in the United 26 States. Animal Science, v.27, n. p. 3941- 3949, 1991. 27 28 MOTELIN, G.K.; HASCHEK, W.M.; NESS, D.K.; HALL, W.F.; HARLIN, K. S.; 29 SCHAEFFER, D. J.; BEASLEY, V. R.Temporal and dose response features in swine 30 fed corn screenings contamined with fumonisin mycotoxins. Mycopathology, v. 126, 31 n.1, p. 27-40, 1994. 32 33 MUNKVOLD, G.P.; DESJARDINS, A.E. Fumonisins in maize – Can we reduce their 34 occurrence? Plant Disease, v.81, n.6, p.556-565, 1997. 35 36 ONOMI, S.; OKAZAKI, Y.; KATAYAMA, T. Effect of dietary level of phytic acid on 37 hepatic and serum lipid status in rats fed a high-sucrose diet. Bioscience, 38 Biotechnology and Biochemistry, v. 68, n.6, p.1379-1381, 2004. 39 40 OSWEILER, G.D., ROSS, P.F., WILSON, T.M.; NELSON, P.E.; WITTE, S. T.; 41 CARSON, T. L.; RICE, R. G.; NELSON, H. A. Characterization of an epizootic of 42 pulmonary edema in swine in corn screening. Journal of Veterinary Diagnostic 43 Investigation, v.4, n. p.53-59, 1992. 44 45 PACHECO, D.G. Efeitos do ácido fítico dietético e da enzima fitase em suínos na 46 fase de terminação e ação do ácido fítico sobre a integridade epitelial das células 47 32 IPEC-1. 127 F. Tese (Doutorado em Ciência Animal), Londrina - Universidade 1 Estadual de Londrina, 2010. 2 3 PLAAMI, S. Myoinositol phsphates: analysis, content in foods and effects in nutrition. 4 Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, v. 30, p. 633-647, 1997. 5 6 PRELUSKY, D.B. et al. Biological fate of fumonisin B1 in food-producing animals. 7 Advances in Experimental Medicine and Biology, New York, v.392, p.265-278, 8 1996. 9 10 PORRES, J.M. et al. Dietary intrinsic phytate protects colon from lipid peroxidation in 11 pigs with a moderately high dietary iron intake. Proceedings of the Society for 12 Experimental Biology and Medicine, v. 221, p. 80-86, 1999. 13 14 POZZI, C.R.; ARCARO, J.R.P.; ARCARO J.R.I.; FAGUNDES, H.; CORREA, B. 15 Aspectos relacionados à ocorrência e mecanismos de ação de fumonisinas. Ciência 16 Rural, v. 32, p. 901-907, 2002. 17 18 PRIOR, R. L.; HOANG, H.; GU, L.; WU, X.; BACCHIOCCA, M.; HOWARD, L.; 19 HAMPSCH-WOODILL, M.; HUANG, D.; OU, B.; JACOB, R.; J. Assays for hydrophilic 20 and lipophilic antioxidant capacity (oxygen radical absorbance capacity (ORAC (FL)) 21 of plasma and other biological and food samples. Journal of Agricultural and Food 22 Chemistry, v.51, n. 11, p. 3273 - 3279, 2003. 23 RANDALL, K. J.; TURTON, J.; FOSTER, J. R. Explant culture of gastrointestinal tissue: 24 a review of methods and applications. Cell Biology and Toxicology, London, v. 27, 25 n. 4, p. 267- 284, 2011. 26 RE, R.; PELLEGRINI, N.; PROTEGGENTE, A.; PANNALA, A.; YANG, M.; RICE-27 EVANS, C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation 28 decolorization assay. Free Radical Biology e Medicine, v.26, n. 9/10, p. 1231-29 1237,1999. 30 31 RILLEY, R.T.; HINTON, D. M.; CHAMBERLAIN, W. J.; BACON, C. W.; WANG, E.; 32 MERRILL, A.H. Jr.; VOSS, K.A. Dietary fumonisin B1 induces disruption of sphingolipid 33 metabolism in Sprague-Dawley rats: a new mechanism of nephrotoxicity. Journal of 34 Nutrition, v. 124, n. p. 594- 603, 1994. 35 36 RODRIGUEZ-AMAYA, D.B.; SABINO, M.; Pesquisa em micotoxinas no Brasil: a última 37 década em foco. Brazilian Journal Microbiology, São Paulo, n 33, p. 1-11, 2002. 38 39 ROSTAGNO, H.S.; SILVA, M.A. Exigências nutricionais e biodisponibilidade de 40 fósforo para frangos de corte. In: Simpósio internacional sobre nutrição de aves, 41 Anais, Campinas: CBNA, p. 1-27, 1998. 42 43 RUSSELL, W. M. S.; BURCH, R. L. 1959. The Principles of Humane Experimental 44 Technique. Disponível em: Acesso: setembro de 2019. 46 47 33 RUSSO, C.; BRACARENSE, A. P. F. R. L. Oxidative stress in dogs. Semina: Ciências 1 Agrárias, v. 37, p. 1431-1440, 2016. 2 3 SANTIN, E.; MAIORKA, A.; ZANELLA, I.; MAGON, L. Micotoxinas do Fusarium spp 4 na avicultura comercial. Ciência Rural, v.31, n.1, p.185- 190, 2000. 5 6 SANTURIO, J.M. Micotoxinas e Micotoxicoses na Avicultura. Revista Brasileira de 7 Ciência Avicola, v.2, n.1, p.01-12, 2000. 8 9 SCHAFER, F. Q.; BUETTNER, G. R. Redox environment of the cell as viewed through 10 the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology 11 Medicine, v.30, n. 11, p.1191-1212, 2001. 12 13 SCHECHTMAN, L. M. Implementation of the 3Rs (Refinement, reduction, and 14 replacement): Validation and regulatory acceptance considerations for alternative 15 toxicological test methods. ILAR Journal, v. 43, supl, p. S85-S94, 2002. 16 17 SCOTT, P.M. Fumonisins. International Journal of Food Microbiology, v.18, p. 257-18 270, 1993. 19 20 SEBBEN V.C., LUGOCH R.W., SCHLINKER C.S., ARBO M.D., VIANNA R.L. 21 Validação de metodologia analítica e estudo de estabilidade para quantificação sérica 22 do paracetamol. Revista Brasileira de Patologia e Medicina Laboratorial, v.46, n.2, 23 p.143-148, 2010. 24 25 SELLE, P. H.; RAVINDRAN, V. Microbial phytase in poultry nutrition. Animal Feed 26 Science and Technology, v. 135, n. p.1–41, 2007. 27 28 SIMÕES, A. O porco: animal sócio cultural total. Mneme – Revista de Humanidades, 29 Caicó (RN), v.4, n.9, p, 44-64, 2004. 30 31 SILVA, A. C. R. A., ALMEIDA, B. F. M., SOEIRO, C. S., FERREIRA, W. L., LIMA, V. 32 M. F. & CIARLINI, P. C. Estresse oxidativo e aumento da apoptose em neutrófilos de 33 cães com azotemia pré-renal. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e 34 Zootecnia,v. 65, n. p.163-170, 2013. 35 36 STOCKMANN-JUVALA, H.; SAVOLAINEN, K. A review of the toxic effects and 37 mechanisms of action of fumonisin B1. Human & Experimental Toxicology, v. 27, p. 38 799- 809, 2008. 39 40 STODOLAK, B.; STARZÝNSKA, A.; CZYSZCZOŃ, M.; ŻYLA, K. The effect of phytic 41 acid on antioxidant stability of raw and cooked meat. Food Chemistry, v. 101, n. 1, p. 42 1041-1045, 2007. 43 44 SWINDLE, M. M.; SMITH, A. C. Comparative and physiology of the pig. Scandinavian 45 Journal of Laboratory Animal Science, Escandinávia, v. 25, p. 11- 21, 1998. 46 Supplement 1 47 34 TARANU, I.; MARIN, D.E.; BOUHET, S.; OSWALD, I.P. Effect of fumonisin on the pig. 1 Mycotoxins in Farm Animals. Transworld Research Network publisher, ISBN: 978-2 81-7895-312-0, Trivandrum-695 023, KERALA. 2008. 3 4 THRALL M.A. et. al. Hematologia e Bioquímica Clínica Veterinária, 2ª ed., 5 Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, p. 349 a 360, 2015. 6 7 TURNER, P. C.; NIKIEMA, P.; WILD, C. P. Fumonisin contamination of food: progress 8 in development of biomarkers to better assess human health risks. Mutation 9 Research, Amsterdam, v.443, p.81-93, 1999. 10 11 VASCONCELOS, S.M.L.; GOULART, M.O.F.; MOURA, J.B.F.; MANFREDINI, V.; 12 BENFATO, M. S.; KUBOTA, L. T. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, 13 antioxidantes e marcadores de dano oxidativo em sangue humano: principais métodos 14 analíticos para sua determinação. Química Nova, v.30, n.5, 2007. 15 16 VATS, P.; BANERJEE, U.C. Production studies and catalytic properties of phytases 17 (myo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolases): an overview. Enzyme and 18 Microbial Technology, v.35, n.1, p.3-14, 2004. 19 20 VITORINO, O. C. L. Micotoxinas na Alimentação e na saúde animal e humana. 21 Dissertação - Mestrado em Engenharia Zootécnica. Universidade de Açores. 2011. 22 23 VOSS, K.A.; RILEY, R.T.; NORRED, W.P.; BACON, C.W.; FILMORE, I.M.; HOWARD, 24 P.C.; PLATTNER, R.D.; COLLINS, T.F.X.; HANSEN, D.K.; PORTER, J.K. An overview 25 of rodent toxicities: liver and kidney effects of fumonisinas and Fusarium moniliforme. 26 Environmental Health Perspectives, v. 109, suppl. 2, p. 259-266, 2001. 27 28 VOSS, K. A.; HOWARD, P.C.; RILEY, R.T.; SHARMA, R.P.; BUCCI, T.J.; 29 LORENTZEN, R.J. Carcinogenicity and mechanism of action of fumonisin B1: a 30 mycotoxin produced by Fusarium moniliforme (=F. verticillioides). Cancer Detection 31 and Prevention, v.26, p. 1–9, 2002. 32 33 VUCENIK, I.; PODECZASY, J.J.; SHAMSUDDIN, A.M. Antiplatelet activity of inositol 34 hexaposphate (IP6). Anticancer Research, v.19, n.5, p.3689-3693, 1999. 35 36 VUCENIK, I.; SHAMSUDDIN, A.M. Protection against cancer by dietary IP6 and 37 Inositol. Nutrition and Cancer, v. 55, p. 109-125, 2006. 38 39 XIMÉNEZ, C.; GONZÁLES, E.; NIEVES, M.; MAGAÑA, U.; MORÁN, P.; GUDIÑO-40 ZAYAS, M.; PARTIDA, O.; HERNÁNDEZ, E.; ROJAS-VELÁSQUEZ, L.; de LEÓN, 41 M.C.G.; MALDONADO, H. Differential expression of pathogenic genes of Entamoeba 42 histolytica vs E. dispar in a model of infection using human liver tissue explants. Plos 43 one, v. 12, n.8, p. 1-22, 2017. 44 45 YAZAR, S.; OMURTAG, G.Z. Fumonisins, trichothcenes and zearalenone in cereals. 46 International Journal of Molecular Sciences, v.9, p. 2062-2090, 2008. 47 48 35 WANG, E., NORRED, W.P., BACON, C.W., RILEY, R.T.; MERRILL, A. H. Jr. Inhibition 1 of sphingolipid biosynthesis by fumonisins implications for diseases associated with 2 Fusarium moniliforme. Journal of Biological Chemistry's, v.266, p.1486-1490, 1991. 3 4 WANG, E.; ROSS, P. F.; WILSON, T.M., RILEY, R.T.; MERRILL, A.H. Jr. Increases in 5 serum sphingosine and sphinganine and decreases in complex sphingolipids in 6 ponies, given, feed containing fumonisins, mycotoxins produced by Fusarium 7 moniliforme. Nutrition: Toxicology and Pharmacology, v.122, p.1706-1716, 1992. 8 9 WANG, E.; RILEY, R.T.; MEREDITH, F.I.; MERRILL, A.H.Jr. Fumonisin B1 10 consumption by rats causes reversible, dose-dependent increases in urinary 11 sphinganine and sphingosine. Journal of Nutrition, v.129, p. 214-220, 1999. 12 13 WESTHUIZEN, L. V. D.; BROWN, N. L.; MARASAS, W. F. O.; SWANEVELDER, S.; 14 SHEPARD, G. S. Sphinganine/Sphingosine ratio in plasma and urine as a possible 15 biomarker for fumonisin exposure in humans in rural areas of Africa. Food and 16 Chemical Toxicology, v. 37, p. 1153-1158, 1999. 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 36 4 HIPÓTESES 1 2  O modelo ex vivo hepático pode ser utilizado como uma alternativa viável 3 dentro do princípio 3Rs da experimentação animal. 4  A fumonisina B1 e o acetaminofeno causam alterações/lesões nos explantes 5 hepáticos. 6  A adição de ácido fítico modula as lesões causadas pela fumonisina B1 e o 7 acetaminofeno. 8 9 37 5 OBJETIVOS 1 2 5.1 OBJETIVO GERAL 3 4  Avaliar os efeitos do ácido fítico (IP6) na hepatotoxicidade produzida pela 5 fumonisina B1 (FB1) ou acetaminofeno em um modelo ex vivo hepático de 6 leitões e suínos de terminação por meio de atividade enzimática, substâncias 7 que indicam função, escore histopatológico e resposta ao estresse oxidativo. 8 9 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 10 11  Padronizar o modelo de explante para avaliação toxicológica hepática; 12  Caracterizar histologicamente alterações induzidas pela FB1 e acetaminofeno 13 nos explantes; 14  Avaliar a resposta ao estresse oxidativo após exposição à FB1 e 15 acetaminofeno; 16  Verificar a eficiência da mensuração de biomarcadores no sobrenadante obtido 17 do meio de cultura como método diagnóstico de lesão, colestase e função 18 hepática; 19  Avaliar os efeitos do IP6 nos explantes submetidos aos tratamentos com FB1 e 20 acetaminofeno; 21  Avaliar os achados histopatológicos, bioquímicos e de resposta ao estresse 22 oxidativo em explantes de suínos de diferentes faixas etárias. 23 24 38 6 ARTIGO I 1 2 Artigo a ser submetido para a revista Food and Chemical Toxicology 3 ISSN: 0278-6915 – Fator de Impacto: 3.775 4 5 Hepatotoxicidade do acetaminofeno em explantes hepáticos de suínos: avaliação dos 6 biomarcadores de integridade celular, sistema biliar, síntese, escore histopatológico e 7 capacidade antioxidante 8 9 Nadia Cristine Weinert 1,2, Ana Paula Frederico R. L. Bracarense2* 10 ¹ Universidade Estadual do Centro Oeste – Unicentro. Email: nadiaweinert@hotmail.com 11 ² Laboratório de Patologia Animal; Universidade Estadual de Londrina - UEL, Paraná 86057-12 970, Brasil; 13 *e-mail: ana.bracarense@pq.cnpq.br 14 15 Resumo: Culturas de tecido de suínos na forma de explantes têm sido utilizadas com sucesso 16 na avaliação de diferentes substâncias, possibilitando a realização de diversos tratamentos 17 simultâneos, de forma rápida e baixo custo. Objetivou-se padronizar um modelo ex vivo para 18 avaliar os efeitos da exposição ao acetaminofeno e ácido fítico (IP6). Explantes hepáticos de 19 nove suínos (120 dias) (GE1) e seis suínos (40 dias) (GE2) foram avaliados e classificados de 20 acordo com um escore lesional histológico, biomarcadores hepáticos e resposta ao estresse 21 oxidativo. Os explantes foram divididos em cinco tratamentos: controle 0h (imediatamente 22 fixado em formol 10%); controle 4h (Ctrl 4 h); IP6 (5mM); grupo exposto ao acetaminofeno 23 (20mM) e acetaminofeno + IP6, durante quatro horas a 37o C. Realizou-se nos tempos de 1/2, 24 2 e 4 horas, a mensuração dos indicadores de lesão hepática, colestase e função. Para o GE1, 25 na presença de IP6, observou-se menor atividade enzimática de FA e GGT, e para o GE2, 26 apenas de GGT, em relação ao controle (p<0,05). Explantes expostos ao acetaminofeno 27 apresentaram redução significativa da atividade de FA, AST, ALT, PT e colesterol em 28 comparação ao controle. Para o GE2, notou-se uma queda significativa na atividade de FA e 29 ALT no grupo acetaminofeno mais IP6 em relação ao controle. Os explantes incubados apenas 30 com meio de cultura (Ctrl 4 h) apresentaram aspectos histológicos similares aos não incubados 31 (Ctrl 0h). Não houve diferença significativa no escore lesional histológico entre os tratamentos 32 nos explantes oriundos do GE1 e GE2. Diminuição significativa nos níveis de TBARS e 33 aumento nos níveis de ABTS e FRAP foi observada nos explantes expostos (GE1) ao 34 acetaminofeno em relação ao controle. No GE2 observou-se aumento significativo nos níveis 35 de NBT e nos níveis de GSH, FRAP e ABTS no grupo acetaminofeno em relação ao controle. 36 Portanto, os resultados indicam que o modelo foi adequado para a avaliação experimental. A 37 exposição à agentes tóxicos é frequente e afeta a saúde animal e humana, portanto o 38 desenvolvimento de mecanismos que reduzam os efeitos tóxicos contribui de modo 39 significativo com a saúde única. 40 41 Palavras-chave: acetaminofeno; ácido fítico; fígado. 42 43 Abstract: Swine tissue cultures in the form of explants have been used successfully in different 44 substances, allowing the realization of several simultaneous uses, quickly and low. Objective: 45 to standardize an ex vivo model to assess the effects of exposure to acetaminophen and phytic 46 acid (IP6). Hepatic explants of nine pigs (120 days-old) (GE1) and six pigs (40 days-old) (GE2) 47 were evaluated and classified according to a lesional histological history, liver biomarkers and 48 response to oxidative stress. The explants were divided into five controls: 0h control (activated 49 39 fixed on the 10% form); control 4h (Ctrl 4h); IP6 (5mM); group exposed to acetaminophen 1 (20mM) and acetaminophen + IP6, for four hours at 37o C. Performed in 1/2, 2 and 4 hours, the 2 measurement of liver injury, cholestasis and function indicators. For GE1, in the presence of 3 IP6, decrease the lower enzyme activity of FA and GGT, and for GE2, only of GGT, compared 4 to the control (p <0.05). Explants exposed to acetaminophen, significantly reducing the activity 5 of FA, AST, ALT, PT and cholesterol compared to control. For GE2, there is no significant 6 probability of AF and ALT activity in the acetaminophen group plus IP6 compared to the 7 control. The explants incubated only with culture media (Ctrl 4h) presented similar historical 8 aspects to those not incubated (Ctrl 0h). There was no significant difference in the histological 9 score between procedures on explants from GE1 and GE2. Significant decrease in TBARS 10 levels and increase in ABTS and FRAP levels were observed in the explants exposed (GE1) to 11 acetaminophen in relation to the control. No GE2 significantly reduced the levels of NBT and 12 GSH, FRAP and ABTS in the acetaminophen group compared to the control. Therefore, the 13 results that the model was suitable for an experimental evaluation. Exposure to toxic agents is 14 frequent and affects animal and human health, therefore, the development of mechanisms that 15 reduce toxic effects contributes a significant effect on unique health. 16 17 Key words: acetaminophen; phytic acid; liver. 18 19 1 INTRODUÇÃO 20 21 O fígado atua de forma direta no armazenamento e degradação de substâncias, 22 hormônios e participa da síntese e secreção de sais biliares, além de promover a regulação dos 23 carboidratos, proteínas e lipídeos. Devido às inúmeras e relevantes funções que o fígado 24 desempenha de forma direta e indireta no organismo, foram desenvolvidas várias técnicas para 25 mensurar o desempenho, bem como apontar possíveis lesões neste órgão (GUYTON, 1997). 26 O modelo ex vivo, caracteriza-se pelo cultivo de fragmentos de órgãos que são colhidos 27 e posteriormente incubados em placas com meio de cultura em temperatura semelhante à 28 corpórea, simulando as condições de um organismo vivo (RANDALL; TURTON; FOSTER, 29 2011). A metodologia dos explantes também proporciona a possibilidade de colher várias 30 amostras de um único doador, aumentando assim a confiabilidade estatística da investigação e 31 reduzindo o número de animais utilizados (KOLF-CLAUW et al., 2009). Explantes de tecidos 32 de suínos têm sido muito utilizados na experimentação animal e uma das finalidades é a 33 observação dos efeitos tóxicos de certas substâncias (BASSO, 2013). Ximénez et al. (2017) 34 empregaram um modelo hepático ex vivo humano para avaliar a expressão diferencial de genes 35 patogênicos de Entamoeba histolytica x E. dispar e a interação hospedeiro-parasita (incluindo 36 a resposta imune humana). 37 O acetaminofeno é um princípio ativo que possui ação analgésica e antipirética 38 (DAHLIN, 1984). A metabolização ocorre no fígado, mais especificamente no retículo 39 endoplasmático liso dos hepatócitos. Este órgão auxilia na depuração de componentes tóxicos 40 que possam vir a causar danos, apresentando uma função detoxificante (BANDEIRA, 2017). 41 40 As vias predominantes da biotransformação de acetaminofeno no fígado são a formação 1 direta de conjugados com o ácido glicurônico e com o sulfato, chamadas de glicuronidação e 2 sulfatação resultando em conjugados inativos atóxicos excretados na urina e na bile 3 (MANYIKE, 2000). Porém, quando o acetaminofeno encontra-se em concentrações elevadas, 4 essas vias se saturam e o princípio ativo passa a sofrer o processo de oxidação mais importante 5 do fígado pelo citocromo P450, formando N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI), que é um 6 metabólito tóxico para o organismo (ANDERSSON, 1990). Entretanto, o organismo tenta 7 compensar esse desbalanço e conjuga esse metabólito com a glutationa, porém um dos 8 principais motivos da intoxicação é a diminuição significativa da glutationa, pois também 9 ocorre a saturação dessa via (MAZRAATI, 2018). Por consequência, o NAPQI pode reagir 10 com as macromoléculas celulares do fígado causando as lesões por toxicidade, sendo a enzima 11 CYP2E1 a principal fonte para o metabolismo oxidativo do acetaminofeno, sendo então o 12 estresse oxidativo conhecido como um dos mecanismos que induz lesão por esse princípio ativo 13 (CHAN et al., 2018). Desta forma, devido ao dano dos lipídios, proteínas da membrana, DNA 14 e carboidratos, ocorrem os distúrbios metabólicos e celulares (MACHADO et al., 2009). 15 A característica bioquímica mais relevante da toxicidade por acetaminofeno é o alto 16 nível de aminotransferases (MAZRAATI, 2018). Atividade enzimática de aspartato 17 aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) são sempre elevadas por 18 consequência de uma exposição a doses altas desse princípio ativo. 19 O ácido fítico (IP6) é um antioxidante vegetal natural, que pode ser encontrado na 20 maioria dos grãos, sementes e feijões e é uma forma utilizada pelas plantas para o 21 armazenamento de fósforo, capaz de inibir a formação de radicais livres (GHIRETTI, 1997). 22 Pelo mesmo mecanismo o ácido fítico pode diminuir a incidência de câncer e proteger contra 23 algumas doenças inflamatórias (GRAF, 1990). Em adição, efeitos protetores foram associados 24 à redução da peroxidação lipídica (DA SILVA, 2014). 25 Levando em consideração os fatores supramencionados, o objetivo desse estudo foi 26 estabelecer um modelo ex vivo para caracterizar alterações estruturais e funcionais hepáticas, 27 por meio da utilização do acetaminofeno e ácido fítico. 28 29 2 MATERIAL E MÉTODOS 30 31 32 Nove suínos em fase de terminação (120 dias) oriundos de frigoríficos da região de 33 Londrina, estado do Paraná, com serviço de inspeção federal (SIF) foram alocados no grupo 34 experimental 1 (GE1) e seis leitões com aproximadamente 40 dias no grupo experimental 2 35 41 (GE2). Os animais do GE1 foram abatidos após insensibilização por eletrocussão seguida de 1 exsanguinação, já os animais do GE2 foram eutanasiados (acepromazina 1%, 40mg/kg de 2 pentobarbital de sódio e KCl 15%). Os procedimentos experimentais foram aprovados pela 3 comissão de ética no uso em animais (CEUA 15-2019). Todos os animais estavam clinicamente 4 saudáveis. Para o GE1 foram colhidos 165 explantes hepáticos e estes divididos em três grupos: 5 controle 4 horas (Ctrl 4h), grupo exposto ácido fítico (5mM) e grupo exposto ao acetaminofeno 6 (20mM). Para o GE2 foram colhidos 147 explantes, além do acréscimo de um quarto grupo 7 exposto ao acetaminofeno (20mM) mais ácido fítico (5mM). Estes explantes foram mantidos 8 incubados durante 4 horas na presença de uma solução de meio de cultura (Dulbecco Modified 9 Eagle Medium - DMEM) suplementado com penicilina-estreptomicina (1%), L-glutamina, 3,7g 10 de NaHCO3 e soro fetal bovino, para posteriormente serem fixados em formol a 10%. 11 Adicionalmente foram colhidos explantes que não foram incubados para análise histológica e 12 comparação com o controle incubado por 4 horas. O acetaminofeno foi utilizado como possível 13 indutor de lesão hepática. 14 15 2.1 Colheita dos explantes 16 17 No ambiente do fluxo laminar foi realizado a colheita dos explantes com auxílio de 18 navalha estéril de micrótomo, depositando os fragmentos nas placas de 6 poços contendo uma 19 cama de 1 ml de ágar-ágar sobreposta por 5 mL de meio de cultura DMEM. Dois explantes 20 foram cultivados por poço, de forma que em cada placa foram incubados 12 explantes. 21 22 2.2 Incubação dos explantes 23 24 Logo após a colheita, as placas contendo os explantes foram mantidas em agitação 25 vertical dentro de uma estufa a 37ºC durante o período de quatro horas. No tempo de trinta 26 minutos, duas e quatro horas de incubação o material era retirado da estufa e em capela de fluxo 27 laminar eram aliquotados 200 μL do sobrenadante de cada poço, sendo este fracionado em 28 quatro tubos eppendorf contendo 50 μL do sobrenadante que foram utilizados para 29 quantificação dos biomarcadores hepáticos. Após o período de incubação de quatro horas, 30 exceto o controle 0 horas (0h) que foi imediatamente fixado após a coleta, os explantes foram 31 retirados da estufa e então foram transferidos para uma solução de formol a 10%. 32 33 42 2.3 Avaliação dos biomarcadores de lesão, colestase e função hepática 1 2 Na avaliação laboratorial foram realizadas as mensurações das atividades enzimáticas: 3 alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST); colestase: fosfatase 4 alcalina (FA) e gama-glutamiltransferase (GGT) e função hepática: colesterol e proteínas totais 5 com intuito de determinar a extensão da hepatotoxicidade possivelmente causada pelo 6 acetaminofeno. O teste cinético de alta sensibilidade foi empregado para mensurar as atividades 7 enzimáticas (ALT, AST, FA e GGT) e o colorimétrico para colesterol e proteína total, 8 utilizando equipamento automático Dimension Clinical Chemistry System® (Siemens, 9 Alemanha) conforme técnica padronizada pelo fabricante no Laboratório de Patologia Clínica 10 do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Londrina. 11 12 2.4 Avaliação histopatológica 13 14 Os fragmentos fixados em solução de formol neutro a 10%, tamponado com fosfato, 15 0,01 M pH 7,4 e mantidos em álcool 70% até o processamento, foram processados seguindo 16 técnicas de rotina sendo corados em hematoxilina-eosina (HE) e então os fragmentos foram 17 analisados por meio de microscopia óptica de acordo com sete critérios (desorganização 18 trabecular, degeneração vacuolar citoplasmática, degeneração vacuolar nuclear, infiltrado 19 inflamatório, megalocitose celular, apoptose e necrose) que foram pontuados conforme a 20 gravidade da lesão: zero (0) para tecidos sem alteração, um (01) para alterações discretas, dois 21 (02) para alterações moderadas e três (03) para alterações graves. 22 23 2.5 Estresse oxidativo 24 25 As amostras de fígado coletadas foram congeladas a -80°C. As amostras congeladas 26 foram processadas e homogeneizadas com 500 μl de KCl (1,15%), depois centrifugadas (200 x 27 g, 10 min, 4ºC) e a capacidade antioxidante total do fígado, no sobrenadante resultante, foi 28 avaliada pelos ensaios potencial de capacidade de redução do ferro (FRAP), redução da 29 glutationa (GSH) e capacidade de eliminação de radicais livres (ABTS) (HOHMANN et al., 30 2013). 31 Para a determinação da resposta oxidativa foram realizados os ensaios de redução do 32 tetrazólio de nitroazul (NBT) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) 33 (HOHMANN et al., 2013; FATTORI et al., 2017). 34 43 2.6 Análise estatística 1 2 Os dados foram analisados utilizando o software Sisvar 5.6 (FERREIRA, 2011). Os 3 dados submetidos a análise estatística foram representados como média ± desvio padrão. Os 4 biomarcadores hepáticos foram analisados por meio de ANOVA fatorial, seguido pelo teste de 5 Tukey assim como o efeito dos tratamentos na resposta oxidativa (GSH, FRAP, ABTS, NBT e 6 TBARS) foram analisados pelo ANOVA, seguido de teste de Tukey (p<0,05), utilizando o 7 software estatístico GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, 38 USA). 8 9 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 10 11 12 Para os biomarcadores hepáticos, avaliou-se primeiramente a atividade enzimática 13 indicadora de lesão hepática e colestase, seguida de análise da função do fígado. Para a 14 atividade enzimática, observou-se efeito significativo dos tratamentos independentemente do 15 tempo de incubação para lesão (ALT e AST), colestase (FA e GGT), assim como para função 16 (proteína total e colesterol), no sobrenadante obtido dos explantes de suínos de terminação 17 (GE1) (Tabela 1). Não foi observada interação entre os tempos estudados em cada tratamento 18 analisado (Tabela 3). Na presença de IP6, foram observados atividade enzimática 19 significativamente menor para a enzima GGT (12,20%) e FA (19,34%) em relação ao grupo 20 controle (p = 0,03; p <0,0001). Quando o acetaminofeno foi adicionado ao meio de cultura, a 21 atividade de FA (7,4%; p< 0,0001), AST (17,16%; p = 0,03), ALT (59,94%; p<0,0001), PT 22 (11,47%; p = 0,02) e colesterol (10,19%; p = 0,0002) diminuíram significativamente em 23 comparação com o controle (Tabela 1). 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 44 Tabela 1 – Efeito do tratamento independentemente do tempo nos parâmetros bioquímicos do 1 sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de suínos de terminação (GE1) expostos ao meio 2 de cultura (Controle); ácido fítico (IP6) e 20 mM de acetaminofeno (Acet) a) . 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 a) Os resultados são expressos como média ± DP. a, b letra minúscula diferente indica significância estatística 17 entre tratamentos independentemente do tempo pela ANOVA fatorial seguida pelo teste de Tukey p≤0,05. 18 FA - fosfatase alcalina; GGT –  - glutamiltransferase; AST – aspartato aminotransferase; ALT – alanina 19 aminotransferase; PT- proteína total; Trat – tratamento. 20 21 Para os leitões (GE2), também não foi observada interação entre os tempos estudados 22 em cada momento analisado (Tabela 4), porém observou-se um efeito significativo do 23 tratamento nas atividades de FA, AST e ALT (p = 0,0002; p = 0,0002; p <0,0001, 24 respectivamente) (Tabela 2). IP6 induziu uma redução significativa de 17,87% na atividade de 25 FA em comparação com o tratamento controle (p = 0,001). Da mesma forma que o GE1, com 26 acetaminofeno diminuiu significativamente, FA (11,86%), AST (27,48%) e ALT (37,66%) em 27 comparação ao grupo controle (p = 0,04; p = 0,001; p <0,0001, respectivamente). Além disso, 28 foi observada uma queda significativa de FA (18,71%) e ALT (36,02%) no grupo 29 acetaminofeno acrescido de IP6 em relação às amostras controle, respectivamente (p = 0,0005; 30 p <0,0001). 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Controle IP6 Acet. FA UI/L 38,04±5,10a 33,40±4,13 b 35,20±2,83 b GGT UI/L 12,77±5,22a 10,30±4,82b 11,42±2,12ab AST UI/L 963,10±216,05a 909,5±265,95 ab 797,80±310,70b ALT UI/L 56,74±29,87a 60,18±34,24a 22,73±11,79b PT g/dL 0,61±0,08a 0,60±0,08a 0,54±0,08b Colesterol g/dL 4,12±0,33a 4,07±0,26a 3,70±0,42b 45 Tabela 2 - Efeito do tratamento independentemente do tempo nos parâmetros bioquímicos do 1 sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de leitões (GE2) expostos ao meio de cultura 2 (Controle); ácido fítico (IP6); 20 mM de acetaminofeno (Acet) e Acet (20mM) mais IP6 3 (5mM)a). 4 a) Os resultados são expressos como média ± DP. a, b letra minúscula diferente indica significância estatística 5 entre tratamentos independentemente do tempo pela ANOVA fatorial seguida pelo teste de Tukey p≤0,05. 6 FA - fosfatase alcalina; GGT –  - glutamiltransferase; AST – aspartato aminotransferase; ALT – alanina 7 aminotransferase; PT- proteína total; Trat – tratamento. 8 9 10 Esses dados diferem substancialmente daqueles encontrados na literatura, nos quais esse 11 princípio ativo (acetaminofeno) leva ao aumento significativo das transaminases (ALT e AST) 12 em altas doses in vivo (McGILL, 2012, VLIEGENTHART et al, 2015). O fator tempo pode ter 13 contribuído com a não elevação das atividades enzimáticas, já que para Larson et al. (2005), 14 em geral, a lesão provocada pelo acetaminofeno no fígado surge 12-72 horas após a ingestão, 15 sendo que no presente estudo a exposição foi de quatro horas. 16 Para modelos ex vivo, não há dados sobre dose hepatotóxica, assim utilizou-se 20 mM 17 referente a um estudo in vitro que utilizou esta dose em fígados de camundongos 18 (AMARAL et al., 2013). A dose de 20mM foi equivalente a 2351,37 mg/kg de acordo com a 19 densidade e pureza de 98% do acetaminofeno no meio de cultura. As doses de 1000 - 2000 20 mg/kg administradas em suínos (in vivo) demostraram intoxicação, levando ao óbito de alguns 21 animais devido a formação de metahemoglobinemia (BRUNS et al.,1988) sendo que a utilizada 22 neste trabalho, encontra-se dentro dos valores tóxicos para a espécie. 23 A redução da atividade enzimática no sobrenadante dos explantes expostos ao 24 acetaminofeno de ambos os grupos (GE1 e GE2) pode ser justificada pela ação anti-inflamatória 25 do fármaco que inibe a cicloxigenase-2 (COX-2), diminuindo a permeabilidade celular 26 (SPINOSA; SCHWARZ, 2008). Outra hipótese, pode estar relacionada ao mecanismo de ação 27 do fármaco, que pode atuar na célula por vias distintas chamadas de glicuronidação e sulfatação, 28 em que correspondem a aproximadamente 60% e 30% da sua metabolização no fígado, 29 Controle IP6 Acet. Acet.+IP6 FA UI/L 41,57±5,34 a 34,14±5,17 b 36,64±6,48 b 33,79±4,92 b GGT UI/L 11,91±1,94 a 11,72±1,95 a 11,30±1,99 a 11,63±1,74 a AST UI/L 596,35±203,77 a 617,32±221,05 a 432,42±121,59 b 562,18±190,72 a ALT UI/L 19,57±6,40 a 19,61±6,30 a 12,20±3,63 b 12,52±4,30 b PT g/dL 0,50±0,04 a 0,47±0,07 a 0,48±0,05 a 0,48±0,06 a Colesterol g/dL 20,76±5,31 a 20,67±5,37 a 20,65±5,41 a 23,02±0,08 a 46 respectivamente, podendo resultar na produção de metabólitos atóxicos pela catalisação por 1 enzimas específicas (McGILL, 2013). As vias que provavelmente foram induzidas, são 2 responsáveis pela diminuição ou não alteração das enzimas de lesão hepática, já que o tempo 3 utilizado para incubação é relativamente curto e essas são as vias primárias da metabolização 4 (MANYIKE, 2000). 5 6 47 Tabela 3 - Efeito do tratamento dependente do tempo nos parâmetros bioquímicos no sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de suínos de 1 terminação (GE1) expostos ao meio de cultura (Controle); ácido fítico (IP6), 20 mM de acetaminofeno (Acet) e Acet (20mM) mais IP6 (5mM). a) 2 3 4 5 Tabela 4 - Efeito do tratamento dependente do tempo nos parâmetros bioquímicos no sobrenadante da cultura de explantes hepáticos de leitões 6 (GE2) expostos ao meio de cultura (Controle – CTRL); Ácido fítico (IP6); 20mM de acetaminofeno (Acet.) e Acet. (20mM) mais IP6 (5mM). a) 7 a) Os resultados são expressos como média ± DP. a, b letra minúscula diferente indica significância estatística entre tratamentos independentemente do tempo pela ANOVA 8 fatorial seguida pelo teste de Tukey p≤0,05. FA - fosfatase alcalina; GGT –  - glutamiltransferase; AST – aspartato aminotransferase; ALT – alanina aminotransferase; PT- 9 proteína total; Col – colesterol; Trat – tratamento.10 30 minutos 2 horas 4 horas Tratamento Valor de p CTRL IP6 Acet CTRL IP6 Acet CTRL IP6 Acet CTRL IP6 Acet Trat2 Tempo Trat* Tempo FA UI/L 38,00± 5,99 34,52± 3,27 36,06±3,3 8 36,96± 4,36 33,32± 2,87 35,72± 2,15 39,14± 4,96 32,36± 5,68 33,,91± 2,71 38,04± 5,10a 33,40± 4,13 b 35,20± 2,83 b <0.0001 0.56 0,44 GGT UI/L 11,18± 3,50 10,50± 3,84 10,33± 2,44 13,82± 7,0 10,82± 4,80 12,17± 1,46 13,30± 4,47 9,51± 3,66 11,76± 2,12 12,77± 5,22a 10,30± 4,82b 11,42± 2,12ab 0.03 0.28 0,71 AST UI/L 931,71± 206,48 894,89± 235,52 609,11± 245,47 1084,29±1 61,06 1031,93±2 10,09 897,56± 264,47 873,3± 230,40 801,61± 307,51 886,69± 351,28 963,10± 216,05 a 909,5± 265,95 ab 797,80± 310,70 b 0,03 0,003 0,13 ALT UI/L 36,25± 16,62 37,20± 17,32 19,00± 11,55 57,21± 22,57 60,00± 31,60 20,28± 10,70 76,76± 33,83 83,34± 35,39 28,91± 11,79 56,74± 29,87 a 60,18± 34,24 a 22,73± 11,79 b <0,0001 <0,0001 0,17 PT g/dL 0,54± 0,06 0,58± 0,09 0,51± 0,08 0,63± 0,06 0,58± 0,09 0,58± 0,07 0,65± 0,08 0,64± 0,06 0,57± 0,10 0,61± 0,08 a 0,60± 0,08 a 0,54± 0,08 b 0,02 0,0003 0,17 Col g/dL 4,07± 0,27 4,07± 0,27 3,89± 0,33 4,21± 0,43 4,07± 0,27 3,78± 0,44 4,07± 0,27 4,07± 0,27 3,67± 0,50 4,12± 0,33 a 4,07± 0,26 a 3,70± 0,42 b 0,0002 0,51 0,64 30 minutos 2 horas 4 horas Tratamento Valor de p CTRL IP6 Acet Acet+ IP6 CTRL IP6 Acet Acet+ IP6 CTRL IP6 Acet Acet+ IP6 CTRL IP6 Acet Acet+ IP6 Trat2 Tempo Trat* Tempo FA UI/L 41,65± 5,91 36,40± 4,41 37,67± 7,04 35,55± 4,22 41,8± 5,82 34,55± 5,30 37,77± 5,96 35,38± 4,61 41,18± 5,28 33,73± 8,27 34,50± 7,03 30,45± 4,81 41,57± 5,34 a 34,14± 5,17 b 36,64± 6,48 b 33,79± 4,92 b 0,0002 0,06 0,93 GGT UI/L 10,57± 0,96 10,60± 1,43 10,78± 1,66 11,10±1 ,24 11,6± 1,39 11,83± 1,43 11,05± 2,17 12,22± 2,32 13,55± 2,11 12,75± 2,48 12,05± 2,24 11,57± 1,61 11,91± 1,94 a 11,72± 1,95 a 11,30± 1,99 a 11,63± 1,74 a 0,78 0,007 0,57 AST UI/L 352,23 ±57,18 385,28± 68,90 317,55 ±43,15 426,38± 232,9 647,07 ±75,65 644,10± 122,48 490,55 ±93,76 613,73± 126,79 789,77± 112,70 822,17± 174,26 489,15± 125,94 646,43± 139,72 596,35± 203,77 a 617,32± 221,05 a 432,42± 121,59 b 562,18± 190,72 a 0,0002 <0,0001 0,08 ALT UI/L 13,67± 3,19 14,33± 4,24 10,17± 2,41 11,43± 5,85 20,0± 4,72 20,00± 4,12 13,67± 3,83 12,00± 1,51 25,00± 5,41 24,50± 6,14 13,50± 4,32 14,12± 4,63 19,57± 6,40 a 19,61± 6,30 a 12,20± 3,63 b 12,52± 4,30 b <0,0001 <0,0001 0,17 PT g/dL 0,47± 0,05 0,42± 0,07 0,47± 0,05 0,43± 0,05 0,52± 0,04 0,50± 0,06 0,50± 0,00 0,50± 0,06 0,50± 0,06 0,52± 0,04 0,47± 0,05 0,50± 0,06 0,50± 0,04 a 0,47± 0,07 a 0,48± 0,05 a 0,48± 0,06 a 0,74 0,0008 0,47 Col, g/dL 20,78± 5,43 20,67± 5,72 20,67± 5,71 23,00±0 ,00 20,67± 5,71 20,67± 5,71 20,62± 5,84 23,05± 0,12 20,83± 5,81 20,67± 5,71 20,67± 5,71 23,00± 0,00 20,76± 5,31 a 20,67± 5,37 a 20,65± 5,41 a 23,02± 0,08 a 0,40 0,99 >0,99 48 Os explantes incubados apenas com meio de cultura durante quatro horas (Ctrl 4 horas) 1 apresentaram aspectos histológicos similares aos explantes não incubados (Ctrl 0 horas). O 2 escore lesional médio nos suínos de terminação foi de 0,56 + 0,70 e 0,94 + 0,68 para o grupo 3 Ctrl 0h e Ctrl 4h, respectivamente. Nos leitões o escore de lesão no grupo 0h foi 2,72+1,67 e 4 no grupo controle 4h, 2,08+1,31. Em ambas as idades os explantes incubados apenas com o 5 meio de cultura (Ctrl 4h) apresentaram discretas alterações caracterizadas por vacuolização 6 citoplasmática (Figura 1). Os resultados indicam que a incubação dos explantes durante 4 horas 7 não interferiu na integridade do tecido hepático, sendo o modelo adequado para avaliação da 8 toxicidade. 9 Os principais achados histológicos nos explantes expostos ao acetaminofeno foram 10 infiltrado inflamatório mononuclear, vacuolização citoplasmática e megalocitose (Figura 1). 11 Não houve diferença significativa no escore de lesão entre os tratamentos, tanto nos animais de 12 terminação como nos leitões (Figura 1). Esses resultados diferem do descrito em ratos expostos 13 a uma única dose de paracetamol (200 mg/kg) em que degeneração hidrópica e necrose de 14 hepatócitos foram observadas (AHMAD et al., 2019). O acetaminofeno é uma das principais 15 causas de lesão hepática em seres humanos e em modelos in vivo, sendo que a dose de 16 400mg/kg/10mL causou degeneração dos hepatócitos, dilatação dos capilares sinusoides, 17 infiltrado inflamatório e necrose em fígado de ratos (NIKRAVESH et al., 2018). Em suínos, 18 uma superdosagem de acetaminofeno causa hepatotoxicidade devido à ação tóxica de seus 19 metabólitos (JAMES et al., 2003), podendo levar a insuficiência hepática aguda na espécie 20 (LEE et al., 2013; NEWSOME et al., 2010). 21 O curto tempo de incubação ou a forma de exposição (contato direto) podem justificar 22 a diferença entre os resultados, pois a dose utilizada (2351,37 mg/kg), é considerada 23 hepatotóxica para a espécie suína (BRUNS et al.,1988). 24 As médias obtidas no GE1 foram 0,94±0,68; 1,36±1,32 e 1,92±1,65 para os grupos Ctrl 25 4h, IP6 e acetaminofeno, respectivamente. Para o GE2 os escores foram 2,08+1,31; 1,72+0,96; 26 1,67+1,24; 1,67+1,08 para os grupos Ctrl 4h, IP6, acetaminofeno e acetaminofeno acrescido de 27 IP6, respectivamente (p>0,05) (Figura 1). 28 29 30 31 32 49 1 2 3 Figura 1 – Efeitos do acetaminofeno e ácido fítico (IP6) em explantes hepáticos de suínos. A. 4 Controle 4 horas. Morfologia hepática normal. HE. Barra 20 m. B. Grupo IP6. Observa-se 5 discreta vacuolização citoplasmática. HE. Barra 20 m. C. Grupo acetaminofeno. Observa-se 6 moderado infiltrado linfocitário periportal. HE. Barra 100 m. D. Grupo IP6+acetaminofeno 7 (GE1). Observa-se discreta desorganização trabecular. HE. Barra 100 m. E. Escore médio de 8 lesão em explantes hepáticos de suínos de terminação (GE1). F. Escore médio de lesão em 9 explantes hepáticos de leitões (GE2). 10 a As médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas barras não mostraram diferença significativa entre os 11 tempos (teste de Tukey, 5% de probabilidade).12 F E C D B A 50 Na avaliação do estresse oxidativo no GE1 não houve diferença significativa entre os 1 tratamentos no ensaio NBT (p>0,05) (Figura 2). Quando há produção de ânion superóxido por 2 fagócitos como macrófagos e neutrófilos é um passo crucial no estresse oxidativo levando à 3 peroxidação lípidica e depleção dos sistemas antioxidantes endógenos gerais (HOHMANN et al., 4 2003). Adicionalmente, a concentração de TBARS no grupo acetaminofeno foi inferior ao grupo 5 controle (p<0,05), indicando que não houve aumento na formação de peróxidos lipídicos e, 6 consequentemente, estresse oxidativo naqueles explantes. 7 8 Figura 2 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 9 hepática (GE1). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Peroxidação lipídica e 10 produção de ânion superóxido. A. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). B. 11 Tetrazólio de nitroazul (NBT). 12 ab As médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas barras não mostraram diferença significativa entre os tempos 13 (teste de Tukey, 5% de probabilidade). 14 15 Porém, ocorreu aumento da capacidade antioxidante (FRAP e ABTS) do grupo acetaminofeno 16 comparado com controle 4h e IP6, sugerindo uma resposta tecidual exacerbada a determinado 17 estímulo causado pelo princípio ativo utilizado, porém sem alterações morfológicas celulares. Houve 18 uma redução do potencial antioxidante fisiológico da glutationa reduzida (GSH) no grupo exposto ao 19 IP6, que pode ser justificada pela atuação exógena deste antioxidante, poupando a liberação 20 fisiológica. A lesão hepática aguda induzida por acetaminofeno é caracterizada por aumento da 21 peroxidação de lipídios e diminuição do funcionamento de enzimas ou sistemas não enzimáticos de 22 defesa antioxidante (EL-SHAFEY et al., 2015), ao contrário do que foi verificado neste estudo, 23 exceto para a glutationa reduzida (Figura 3). 24 A B 51 1 2 Figura 3 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 3 hepática (GE1). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Defesa hepática antioxidante. 4 A. Capacidade de eliminação de radicais livres (ABTS). B. Glutationa reduzida (GSH). C. Potencial 5 de redução do ferro (FRAP). 6 ab As médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas barras não mostraram diferença significativa entre os tempos 7 (teste de Tukey, 5% de probabilidade). 8 9 Já para o GE2 (Figura 4), em relação a toxicidade do acetaminofeno, não houve diferença para 10 o ensaio TBARS, porém para o NBT ocorreu diferença entre o controle 4h e acetaminofeno, sendo 11 maior para este último (p = 0,0245), além de diferença entre o tratamento IP6 (p=0,0002) e 12 acetaminofeno acrescido de ácido fítico (p= 0,0151), com o tratamento acetaminofeno, sendo este 13 superior do que ambos. Provavelmente ocorreu um estímulo de aumento de permeabilidade/lesão 14 celular quando em contato com o acetaminofeno, pois é um fármaco que aumenta a peroxidação de 15 lipídios em altas doses, podendo causar hepatotoxicidade (JÚNIOR, 2011; EL-SHAFEY et al., 2015). 16 B A C 52 1 Figura 4 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 2 hepática (GE2). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Peroxidação lipídica e 3 produção de ânion superóxido. A. Substâncias reativas ao ácido tiobárbiturico (TBARS). B. 4 Tetrazólio de nitroazul (NBT). 5 ab As médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas barras não mostraram diferença significativa entre os tempos 6 (teste de Tukey, 5% de probabilidade). 7 8 Houve aumento da capacidade antioxidante (GSH, FRAP e ABTS) do grupo acetaminofeno 9 comparado com controle 4h, IP6 e acetaminofeno acrescido de ácido fítico, sugerindo uma resposta 10 tecidual exacerbada a determinado estímulo causado pelo princípio ativo utilizado, porém sem 11 alterações morfológicas celulares. Para o ensaio de GSH, houve diferença entre os grupos controle e 12 acetaminofeno (p= 0,0122), ácido fítico e acetaminofeno (p=0,0045) e acetaminofeno com 13 acetaminofeno acrescido de ácido fítico (p= 0,0049), sendo superior nos três casos, no grupo 14 acetaminofeno (Figura 5). 15 Para a capacidade antioxidante total (ABTS), os grupos controle e ácido fítico diferiram com 16 o grupo acetaminofeno (p<0,0001), sendo superior os valores para este grupo, além deste direrir 17 também do grupo acetaminofeno com ácido fítico (p=0,0039), sendo inferior para este último. No 18 ensaio de redução de ferro (FRAP), ocorreu diferença entre todos os grupos (p < 0,0001), exceto para 19 o controle e ácido fítico. 20 Como houve aumento da capacidade antioxidante hepática no GE2, pode-se inferir que leitões 21 apresentam mecanismos de desintoxicação dependentes de glutationa, superior aos suínos terminação 22 (GE1) que tiveram diminuição desta defesa antioxidante (EL-SHAFEY et al., 2015). Em crianças 23 com idade inferior a 5 anos, foi comprovada menor susceptibilidade à hepatotoxicidade pelo 24 acetaminofeno em decorrência da menor produção de NAPQI e em adultos ocorreu um aumento da 25 metabolização pelo citocromo P450 (JUNIOR, 2011). 26 A glutationa é produzida pela própria célula hepática e é constituída pelos aminoácidos: 27 glutamina, glicina e cisteína. Quando concentrações maiores de acetaminofeno são usadas, ocorre 28 esgotamento da glutationa e o composto tóxico se acumula, resultando em dano hepático 29 B A 53 (MÜHLBAUER, 2016) não observado no GE2. Estes achados, concordam com os valores obtidos 1 pelas dosagens bioquímicas, indicando que provavelmente não houve alterações morfológicas 2 relevantes nos hepatócitos expostos ao acetaminofeno, evidenciada pela intensa capacidade 3 antioxidante, sendo que a L-glutamina suplementada no meio de cultura, pode ter contribuído com a 4 formação de GSH, participando da desintoxicação dos metabólitos produzidos pelo acetaminofeno 5 no fígado (TRUMPER, et al.1996; MAZER; PERRONE, 2008). A glutamina é o aminoácido mais 6 abundante no corpo e desempenha um papel central no crescimento e manutenção celular. Em cultura, 7 células utilizam a glutamina em quantidades superiores a de qualquer outro aminoácido (CURI et al., 8 2005). 9 Con tro le IP6 Acet am inofe no Acet am ino fen o+ IP6 10 11 Figura 5 - Efeitos do acetaminofeno (20mM) e ácido fítico (IP6) (5 mM) na resposta oxidativa 12 hepática (GE2). Controle 4 horas; IP6 (5mM); Acetaminofeno (20mM). Defesa hepática antioxidante. 13 A. Capacidade de eliminação de radicais livres (ABTS). B. Glutationa reduzida (GSH). C. Potencial 14 de redução do ferro (FRAP). 15 ab As médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas barras não mostraram diferença significativa entre os tempos 16 (teste de Tukey, 5% de probabilidade). 17 18 O tempo de incubação é um fator limitante do modelo. A incubação de tecidos com elevada 19 metabolização por períodos superiores a quatro horas induz a perda da viabilidade tecidual decorrente 20 da hipóxia prolongada (RANDALL; TURTON; FOSTER, 2011). O modelo utilizado mostrou-se 21 adequado para avaliação de hepatotoxicidade, no entanto, são necessários mais estudos para 22 C A B 54 aprimorar o método, visando avaliar o tempo de incubação com a preservação da celularidade do 1 órgão. 2 3 4 CONCLUSÃO 4 5 Conclui-se que a técnica de explante hepático ex vivo é viável para avaliação de 6 hepatotoxicidade no período de incubação de quatro horas auxiliando na redução do número de 7 animais na experimentação. A similaridade anatômica e fisiológica do homem com a espécie suína, 8 faz com que estes resultados sejam relevantes. Porém, os mecanismos da lesão hepática induzida por 9 acetaminofeno são altamente complexos e muitos eventos intracelulares e extracelulares estão 10 envolvidos neste processo fisiopatológico, incluindo metabolismo do acetaminofeno, estresse 11 oxidativo mitocondrial, disfunção celular, inflamação, além da regeneração hepática, que ainda 12 precisam ser elucidados, principalmente entre diferentes faixas etárias. O pré-tratamento com 13 glutamina e o mecanismo dos efeitos protetores do ácido fítico ainda precisam ser melhor elucidados, 14 porém podem ser uma opção para prevenir danos funcionais e estruturais hepáticos promovidos pela 15 acetaminofeno. 16 17 Limitações: O fator tempo (4 horas) e o contato direto do acetaminofeno com o explante, sem o 18 cumprimento completo da farmacocinética, pode ter contribuído com a não elevação da atividade 19 enzimática no modelo. Porém é importante ressaltar que este fármaco, apesar da baixa capacidade 20 anti-inflamátoria, é considerado um AINE, o que pode ter contribuído com o resultado obtido, além 21 de que as vias primárias de metabolização são consideradas atóxicas. 22 Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesse. 23 Referências 24 25 AHMAD, M.M.; REZK, N.A.; FAWZY, A.; SABRY, M. Protective effects of curcumin and 26 silymarin against paracetamol induced hepatotoxicity in adult male albino rats. Gene, v. 712: 143966, 27 2019. 28 29 AMARAL, S.S.; OLIVEIRA, A.G.; MARQUES, P.E.; QUINTÃO, J.L.; PIRES, D.A.; RESENDE, 30 R.R.; SOUSA, B.R.; MELGAÇO, J.G.; PINTO, M.A.; RUSSO, R.C.; GOMES, A.K.; ANDRADE, 31 L.M.; ZANIN, R.F.; PEREIRA, R.V.; BONORINO, C.; SORIANI, F.M.; LIMA, C.X.; CARA, D.C.; 32 TEIXEIRA, M.M.; LEITE, M.F.; MENEZES, G.B. Altered responsiveness to extracellular ATP 33 enhances acetaminophen hepatotoxicity. Cell Communication Signalling, v.11, n.10, 2013. 34 35 ANDERSSON, B. S. et al. N-acetyl-p-benzoquinone imine-induced changes in the energy 36 metabolism in hepatocytes. Chemico-Biological Interactions, 75 (2):201-211, 1990. 37 38 BANDEIRA, A. C. B. Avaliação do efeito protetor do licopeno em um modelo de 39 hepatotoxicidade induzida por paracetamol em camundongos C57BL/6. 2017. 125 f. Tese 40 55 (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade 1 Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2017. 2 3 BASSO, K.M. et al. Tissue explants: a model rediscovered in animal experiments. Semina: Ciências 4 Agrárias, Londrina, 34(6) suplemento 2: 3951-3958, 2013. 5 6 BRUNS, D. H.; ARTWOHL, J.; BROELSCH, C.; KREMER, B. Acetaminophen-induced acute 7 hepatic failure in pigs: controversical results to other animal models. Research in Experimental 8 Medicine, Berlim, v.188, n. p.463–472, 1988. 9 10 CHAN, C. Y. et al. Reactive Metabolite-induced Protein Glutathionylation: a Potentially Novel Mechanism 11 Underlying Acetaminophen Hepatotoxicity. Molecular & Cellular Proteomics, 17 (8): 1-57, 2018. 12 13 CURI, R., LAGRANHA, C.J., DOI, S.Q., SELLITTI, D.F., PROCOPIO, J., PITHON-CURI, T.C., et al. 14 Molecular mechanisms of glutamine action. Journal Cell Physiology, 204: 392-401, 2005. 15 DAHLIN D.C. et al. N-Acetyl-p-benzoquinone imine; a cytochrome P-450-mediated oxidation 16 product of acetaminophen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81(5): 1327-17 133, 1984. 18 19 DA SILVA, E.O.; GEREZ, J.R.; DRAPE, T.C.; BRACARENSE, A.P.F.R.L. Phytic acid decreases 20 desoxynivalenol and fumonisin B1-induced changes on swine jejunal explants. Toxicology Reports, 21 1(1): 284-292, 2014. 22 23 EL-SHAFEY, M.M.; ABD-ALLAH, G.M.; MOHAMADIN, A. M.; HARISA, G.I.; MARIEE, A.D. 24 Quercetin protects against acetaminophen-induced hepatorenal toxicity by reducing reactive oxygen 25 and nitrogen species, Pathophysiology, 22(1): 49-55, 2015. 26 27 FATTORI, V., BORGHI, S. M.; GUAZELLI, C. F. S.; GIROLDO, A. C.; CRESSWINEIO, J.; 28 BUSSMANN, A. J. C.; COELHO-SILVA, L.; . LUDWIG, N. G.; MAZZUCO, T. L.; 29 CASAGRANDE, R.; VERRI, W.A. Vinpocetine reduces diclofenac-induced acute kidney injury 30 through inhibition of oxidative stress, apoptosis, cytokine production, and NF-κB activation in mice. 31 Pharmacological Research, 120:10-22, 2017. 32 33 FERREIRA, D. F. Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciência e Agrotecnologia, 34 35(6):1039-1042, 2011. 35 36 GHIRETTI, G. P. et al. Comparative evaluation of some antioxidants in salame Milano and 37 mortadella production. Meat Science, 47(1-2): 167-176, 1997. 38 39 GRAF, E. et al. Antioxidant functions of phytic Acid. Free Radical Biology & Medicine, 8(1):61-40 69, 1990. 41 42 GUYTON A. C. Tratado de Fisiologia Médica, 9ª ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, c. 70, p. 43 672, 1997. 44 45 HOHMANN, M. S. N.; CARDOSO, R. D. R.; PINHO-RIBEIRO, F. A.; CRESSWINEIO, J.; 46 CUNHA, T. M.; ALVES-FILHO, J. C.; DA SILVA, R.V.; PINGE-FILHO, P.; FERREIRA, S. H.; 47 56 CUNHA, F. Q.; CASAGRANDE, R.; VERRI, W. A. 5-lipoxygenase deficiency reduces 1 acetaminophen-induced hepatotoxicity and 14 lethality. BioMed Research International, 2013: 2 627046. 3 4 JAMES, L. P.; MAYEUX, P.R., HINSON, J.A. Acetaminophen-induced hepatotoxicity, Drug 5 Metab. Dispos, v.31, p. 1499-1506, 2003. 6 7 JUNIOR E.V.M. Situações que favorecem ou reduzem a hepatotoxicidade pelo acetaminofem. 8 Revista Suplem. Hepatotoxicidade, 30(1): 06-47, 2011. 9 10 KOLF-CLAUW, M.; CASTELLOTE, J.; JOLY, B.; BOURGES-ABELLA, N.; RAYMOND-11 LETRON, I.; PINTON, P.; OSWALD, I. P. Development of a pig jejunal explant culture for studying 12 the gastrointestinal toxicity of the mycotoxin deoxynivalenol: histopathological analysis. Toxicology 13 in Vitro, 23(8):1580-1584, 2009. 14 15 LARSON, A.M.; POLSON, J.; FONTANA, R.J.; DAVERN, T.J.; LALANI, E.; HYNAN, L.S. et al. 16 Acetaminophen induced acute liver failure: results of a United States multicenter, prospective study. 17 Hepatology, 42(6):1364–72, 2005. 18 19 MACHADO, L. P.; KOHAYAGAWA, A.; SAITO, M. E.; SILVEIRA, V.F. DA; YONEZAWA, L. 20 A. Erythrocyte oxidative injury and antioxidant mechanisms of interest in Veterinary Medicine. 21 Revista de Ciências Agroveterinárias, 8: 84-94, 2009. 22 23 MANYIKE, P.T. et al. Contribution of CYP2E1 and CYP3A to acetaminophen reactive metabolite 24 formation. Clinical Pharmacology & Therapeutics,67(3):275-282, 2000. 25 26 MAZER M.; PERRONE J. Acetaminophen-induced nephrotoxicity: Pathophysiology, clinical 27 manifestations, and management. Journal of Medical Toxicology, 4: 2-6, 2008. 28 29 MAZRAATI, P.; MINAIYAN, M. “Hepatoprotective Effect of Metadoxine on Acetaminophen-30 Induced Liver Toxicity in Mice”. Advanced Biomedical Research, 7(67): 2018. 31 32 McGILL, M. R. et al. The Mechanism Underlying Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in 33 Humans and Mice Involves Mitochondrial Damage and Nuclear DNA Fragmentation. The Journal 34 of Clinical Investigation, 122(4):1574-1583, 2012. 35 36 McGILL, M. R.; JAESCHKE, H. Metabolism and disposition of acetaminophen: recent advances in 37 relation to hepatotoxicity and diagnosis. Pharmaceutical Research, 30(9): 2174-2187, 2013. 38 39 MÜHLBAUER, M. Paracetamol, um AINE particular. Ciência Atual, v.7, n.1, p. 02-10, 2016. 40 41 NEWSOME, P.N.; HENDERSON, N.C.; NELSON, L.J.; DABOS, C.; FILIPPI, C.; BELLAMY, C.; 42 HOWIE, F.; CLUTTON, R.E.; KING, T.; LEE, A.; HAYES, P.C.; PLEVRIS, J.N. Development of 43 an invasively monitored porcine model of acetaminophen-induced acute liver failure. BMC 44 Gastroenterol, v.10, p. 34. 2010. 45 46 57 NIKRAVESH, H. et al. “Protective Effect of Gemfibrozil on Hepatotoxicity Induced by 1 Acetaminophen in Mice: The Importance of Oxidative Stress Suppression” Advanced 2 Pharmaceutical Bulletin, 8(2):331–339, 2018. 3 4 RANDALL, K. J.; TURTON, J.; FOSTER, J. R. Explant culture of gastrointestinal tissue: a review 5 of methods and applications. Cell Biology and Toxicology, London, 27(4): 267-284, 2011. 6 7 SPINOSA H. S.: SCHWARZ, A. Toxicologia aplicada à medicina veterinária. Barueri, SP: 8 Manole, 2008. 980p. 9 10 STIRNIMANN, G.; KESSEBOHM, K.; LAUTERBURG, B. Liver injury caused by drugs: an update. 11 Swiss Medical Weekly, 140, 2010. 12 13 TRUMPER, L.; MONASTEROLO, L.A.; ELIAS, M.M. Nephrotoxicity of acetaminophen in male 14 Wistar rats: role of hepatically derived metabolites. Journal of Pharmacology and Experimental 15 Therapeutics, 279: 548–54, 1996. 16 17 VLIEGENTHART, A.D.B.; ANTOINE, D.J., DEAR. J.W., Target biomarker profile for the clinical 18 management of paracetamol overdose Br. J Clin Pharmacol, v. 80, p. 351–362, 2015. 19 20 XIMÉNEZ, C.; GONZÁLES, E.; NIEVES, M.; MAGAÑA, U.; MORÁN, P.; GUDIÑO-ZAYAS, 21 M.; PARTIDA, O et al. Differential expression of pathogenic genes of Entamoeba histolytica vs E. 22 dispar in a model of infection using human liver tissue explants. Plos one, 12(8):1-22, 2017. 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 58 1 7 ARTIGO II 2 Article to be submitted the Toxins 3 ISSN 2072-6651– Fator de Impacto 3.895 4 Effects of the Phytic Acid and Injury Induced by Fumonisin (FB1) in Liver Explants of Piglets 5 and Finishing Pigs: Oxidative Stress, Histological Lesions and Biomarkers 6 Nadia Cristine Weinert 1,2, Ana Paula Frederico R. L. Bracarense2* 7 ¹ Veterinary Medicine Teacher of Guarapuava State Central-West University, Paraná, Brazil; 8 nadiaweinert@hotmail.com 9 ² Laboratory of Animal Pathology, Londrina State University Londrina, Paraná 86057-970, Brazil; 10 *Correspondence: ana.bracarense@pq.cnpq.br 11 12 Abstract: Mycotoxins are found in many foods and can cause health damage.The development of 13 mechanisms that reduce these toxic effects contributes to individual health. The objective of this study 14 was to establish an ex vivo model to characterize liver histological changes by evaluating the effects 15 of fumonisin (FB1) and phytic acid (IP6) exposure. Hepatic explants from nine swine (120 days old) 16 (EG1) and six piglets 40-days old (EG2) were evaluated in the following treatments: control 0h; 17 control 4 h (Ctrl 4); FB1 (100 μM); IP6 (5 mM) and FB1 (100 μM) + IP6 (5 mM). The explants were 18 incubated for 4h and half, two and four hours of biomarkers of lesion, colestase and liver function 19 were evaluated. There was no difference in the injury score for GE1 and GE2. For GE1 and GE2, the 20 IP6 and FB1 + IP6 treatments were responsible for the significant decrease in the enzymatic activity 21 of FA compared to the control and FB1. When IP6 was added to FB1, there was a reduction in ALT 22 and PT activity compared to FB1 and the control. For GE1 and GE2, exposure to FB1 induced an 23 increase in GSH compared to IP6 and control, respectively, while incubation with FB1 + IP6 24 decreased GSH compared to FB1. This model was suitable for toxicological evaluation demonstrating 25 the hepatoprotective effect of IP6, can be added to animal feed. 26 27 Keywords: fumonisins; hepatotoxicity; mycotoxins; reactive oxygen species 28 29 Key Contribution: FB1 induces in the increase of GSH and NBT in oxidative stress, morphological 30 alteration (nuclear and cytoplasmic vacuolization and megalocytosis) and increase of liver enzymes 31 (ALP, ALT and AST) dosed in the supernatant of the culture medium of the swine liver explants. 32 Phytic acid modulates the enzymatic increases and the oxidative stress induced by FB1. 33 1 Introduction 34 Food and feed are subjected to contamination by highly toxic substances [1, 2]. Mycotoxins 35 are low molecular weight natural products (small molecules) produced as secondary metabolites by 36 filamentous fungi. These metabolites are a toxigenic and chemically heterogeneous group that can 37 cause disease and death in humans and other vertebrates [3]. 38 59 Mycotoxicosis in pigs are responsible for significant losses in production [4]. Fumonisins are 1 produced by the genus Fusarium spp. and are hepatotoxic for all species, regardless of the route of 2 administration. The liver disease in animals and humans can progress rapidly to insufficiency, despite 3 the liver's regenerative capacity. Hepatocyte lesions can be detected by measuring the serum enzymes 4 released by hepatocyte rupture, providing information on the extent, magnitude and course (acute or 5 chronic) of this lesion [5]. In addition, increased serum bilirubin and cholesterol may occur [6]. In 6 pigs high-doses of FB1 induce pulmonary edema and hydrothorax due to reduced left ventricular 7 mechanical efficiency and L-type calcium channel blockage [7]. In acute liver abnormalities, 8 trabecular disorganization, hepatocellular vacuolization, megalocytosis, apoptosis and necrosis have 9 been reported [8]. 10 At the cellular level, FB1 alter sphingosine biosynthesis by inhibiting the enzyme ceramide 11 synthetase. Interruption of sphingolipid production is important as they are essential elements of cell 12 membranes and have a regulatory function of eukaryotic cells [9]. The intracellular action of these 13 mycotoxins has been elucidated, and the induction of oxidative stress and generation of radical 14 oxygen species (ROS) plays an important role in their toxic effects, as observed in vivo [10,11] and 15 in vitro [12, 13]. However, the association between liver lesions and oxidative stress induced by FB1 16 has not been elucidated and most studies focusing on the effects of FB1 on oxidative stress have been 17 performed in vitro or using laboratory mammals and chickens [14]. The body has a complex system 18 of antioxidant protection as a defense mechanism against free radicals, which are constantly formed 19 in normal cell metabolism and various pathological events and, when in excess, can cause the 20 oxidation of biological molecules. The imbalance between the oxidative challenge and the antioxidant 21 defense capacity of the organism results in oxidative stress [15]. 22 Free radicals, more specifically ROS, are continuously produced within the cell as a result of 23 normal physiological processes and many of them are required for certain biological reactions. An 24 overproduction of these free radicals and/or the deactivation of the cellular defense mechanisms 25 involved in free radical protection will result in an overall rise in their concentrations and eventually 26 give rise to cellular damage [16]. The excess of free radicals in the body is counteracted by 27 antioxidants produced by the body or absorbed in the diet and can be defined as any substance that, 28 when present in a low concentration compared to that of the oxidizable substrate, regenerates the 29 substrate or significantly oxidation [17]. Many factors, including toxins, have the ability to interfere 30 with free radical related processes, thereby inducing oxidative stress in the target cells, which could 31 lead to metabolic and cellular disturbances mainly due to the damage of membrane lipids and 32 proteins, DNA, and carbohydrates [18]. 33 60 Therefore, the search for substances capable of mitigating the toxic effects of mycotoxins is 1 essential and some studies with phytic acid (IP6) like antioxidant have already been carried out [19]. 2 IP6 is a natural antioxidant found in cereals, nuts, legumes, oilseeds, spores and pollen. Its antioxidant 3 property results from the ability to bind iron [20]. In the literature, some studies have already 4 demonstrated its protective effects against the action of several mycotoxins in the intestine, 5 demonstrating the reduction of toxic effects by deoxynivalenol and fumonisin B1 [19, 21], however, 6 there are no data on the possible effects beneficial effects on the liver. Thus, the development of 7 mechanisms that reduce the toxic effects of mycotoxins, such as IP6, can contribute effectively to one 8 health, since exposure to mycotoxins is frequent and significantly affects the health of humans and 9 animals [22]. 10 Pigs exhibit physiological characteristics similar to humans leading to an increase use as 11 animal models in laboratory studies. These similarities are observed in several systems, with the 12 gastrointestinal, cardiovascular and pulmonary systems being the most used in laboratory research 13 [23]. Other organs such as the skin, liver and gall bladder of swines are also used in experimental 14 models for humans [24]. 15 As an alternative to in vivo evaluation, ex vivo models such as extracorporeal organ 16 maintenance and explant techniques have shown promising results. The advantages of the technique 17 include the decrease in the number of animals used in the experiment, and the use of animals from 18 abattoirs prevents the euthanasia for experimentation. This is important because, in addition to 19 adapting to ethical and legal aspects, there are many other advantages, including: better environmental 20 control, application of the substance dose directly to the target, and more reliable results, since 21 treatments and control are performed from the same donor. The ex vivo model is an attractive 22 technique, but it has some limitations such as tissue incubation time, cell viability and maintenance 23 of the existing in vivo [25]. 24 Considering the mentioned data, the present study aimed to validate the hepatic explant 25 model and also to evaluate the effect of IP6 on liver explants in pigs exposed to FB1 using liver 26 biomarkers, histological lesions and oxidative stress response assays. The model used was suitable 27 for evaluating hepatotoxicity, however, further studies are needed to improve the method, aiming to 28 increase the incubation time with the preservation of the tissues morphological structures. 29 2 Results 30 61 2.1 Enzyme evaluation and liver function 1 2 Two different analysis were performed concerning biochemical parameters. We have 3 evaluated differences among the periods of incubation (30 min, 2 and 4 h) and among the treatments. 4 In the experimental group one (EG1), the factorial analysis of the biochemical data from 5 supernatant of finishing pigs explants culture revealed no interaction effect between factors 6 (treatments x time), but a significant effect of the treatment in the ALP, ALT, and PT levels was 7 observed (p < 0.0001; p = 0.04; p = 0.02) (Table 1; Table 3). The treatments IP6 and FB1+IP6 were 8 responsible for a significant decrease in the ALP levels in relation to control (12.20%, p < 0.0001; 9 11.51%, p < 0.0001) and FB1 groups (14.90%, p < 0.0001; 14.24%, p < 0.0001), respectively. In 10 addition, when IP6 was added to FB1 a significant reduction in the levels of ALT (35.33%, p = 0.005) 11 and TP (8.33%, p = 0.02) was observed compared to FB1 and control groups, respectively. 12 Table 1 - Effect of treatment independently of the time on the biochemical parameters in the culture 13 supernatant of hepatic explants of finishing pigs (EG1) exposed to the culture medium (Control - 14 CTRL); 5 mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100M) µM plus IP6 15 (5mM) a). 16 17 a) Results are expressed as mean±SD. a, b Different lower case letter indicates statistical significance between 18 treatments independently of the time by factorial ANOVA followed by Tukey’s test P≤0.05. ALP – alkaline 19 phosphatase; GGT - -glutamyltransferase; AST - aspartate aminotransferase; ALT - alanine aminotransferase; 20 TP - total protein; Chol - cholesterol; Treat – treatment. 21 22 As shown in table 2 and table 4, no significant interaction effect was found between treatment 23 and time for biochemical parameters observed in the tissue culture of piglets (EG2). In contrast, 24 treatment effect was observed in the concentrations of ALP, AST, and ALT (p < 0.0001; p = 0.0007; 25 p < 0.0001). In the IP6 and FB1+IP6 groups a significant decrease in the ALP levels was observed 26 when compared to the control (16.07%, p = 0.004; 16.91%, p = 0.002) and FB1 treatments (17.32%, 27 p = 0.002; 18.15%, p = 0.0009), respectively. In contrast, AST levels were significantly increased 28 Control IP6 FB1 FB1+IP6 ALP UI/L 38.04±5.19a 33.40±4.13b 39.25±2.92a 33.66±2.57b GGT UI/L 12.77±5.22a 10.71±4.82a 12.30±2.93a 10.17±3,28a AST UI/L 963.10±216.05a 909.50±265.95a 923.50±295.10a 897.60±308.57a ALT UI/L 56.74±29.87ab 60.18±34.24ab 70.23±30.56a 45.42±29.78b TP g/dL 0.60±0.08a 0.60±0.08ab 0.58±0.07ab 0.55±0.07b Chol g/dL 4.12±0.33a 4.07±0.26a 4.22±0.40a 4.07±0.27a 62 in the culture supernatant of the hepatic explants exposed to FB1 plus IP6 in relation to FB1 treatment 1 (1.4 fold increase, p= 0.008). In addition, FB1 induced a significant increase of ALT levels compared 2 to control (40.41%, p < 0.0001), IP6 (40.29%, p < 0.0001) and FB1 plus IP6 (43.73%, p < 0.0001) 3 treatments. 4 Table 2 - Effect of treatment independently of the time on the biochemical parameters in the culture 5 supernatant of hepatic explants of piglets (EG2) exposed to the culture medium (Control - CTRL); 6 5 mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100M) µM plus IP6 (5mM) a). 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 a) Results are expressed as mean±SD. a, b Different lower case letter indicates statistical significance between 17 treatments independently of the time by factorial ANOVA followed by Tukey’s test P≤0.05. ALP – alkaline 18 phosphatase; GGT - -glutamyltransferase; AST - aspartate aminotransferase; ALT - alanine aminotransferase; 19 TP - total protein; Chol - cholesterol; Treat – treatment. 20 21 22 Control IP6 FB1 FB1+IP6 ALP UI/L 41.57±5.34a 34.89±5.95b 41.99±5.08a 34.37±5.37b GGT UI/L 11.91±1.94a 11.72±1.95a 12.30±3.56a 11.20±1.59a AST UI/L 596.35±203.77ab 617.32±221.0 ab 518.87±184.8b 714.57±275.04a ALT UI/L 19.57±6.40b 19.61±6.30b 32.84±9.12a 18.48±9.82b TP g/dL 0.50±0.04a 0.47±0.07a 0.47±0.05a 0.47±0.06a Chol g/dL 20.76±5.31a 20.67±5.37a 20.69±5.38a 21.70±3.86a 63 Table 3 - Effect of treatment dependently of the time on the biochemical parameters in the culture supernatant of hepatic explants of finishing pigs (EG1) 1 exposed to the culture medium (Control - CTRL); 5mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100 µM) plus IP6 (5mM) a). 2 3 4 5 Table 4 - Effect of treatment dependently of the time on the biochemical parameters in the culture supernatant of hepatic explants of piglets (EG2) exposed to 6 the culture medium (Control - CTRL); 5 mM of phytic acid (IP6); 100 µM of fumonisin B1 (FB1) and FB1 (100M) µM plus IP6 (5mM) a). 7 a) Results are expressed as mean±SD. a, b Different lower case letter indicates statistical significance between treatments independently of the time by factorial ANOVA followed 8 by Tukey’s test P≤0.05. ALP – alkaline phosphatase; GGT - -glutamyltransferase; AST - aspartate aminotransferase; ALT - alanine aminotransferase; TP - total protein; Chol 9 - cholesterol; Treat – treatment.10 30 minutes 2 hours 4 hours Treatment P-value CTRL IP6 FB1 FB1+IP6 CTRL IP6 FB1 FB1+IP6 CTRL IP6 FB1 FB1+IP6 CTRL IP6 FB1 FB1+IP6 Treat2 Time Treat * Time ALP UI/L 38.00± 5.99 34.52± 3.27 37.56± 2.36 34.11± 2.88 36.96± 4.36 33.32± 2.87 39.17± 2.76 33.67± 2.75 39.14± 4.95 32.36± 5.68 41.02± 2.78 33.20± 2.26 38.04± 5.19a 33.40± 4.13b 39.25± 2.92a 33.66± 2.57b <0.0001 0.75 0.32 GGT UI/L 11.18± 3.51 10.50± 3.84 10.72± 2.88 10.83± 2.45 13.82± 7.03 10.82± 4.80 12.11± 1.85 10.39± 2.91 13.30± 4.47 10.80± 5.96 14.08± 3.14 9.30± 2.60 12.77± 5.22a 10.71± 4.82a 12.30± 2.93a 10.17± 3.28a 0.06 0.46 0.65 AST UI/L 931.71± 206.48 894.89± 235.52 926.20± 260.20 774.94± 255.11 1084.29± 161.93 1031.9± 210.09 938.28± 190.29 1098.3± 189.22 873.31± 230.40 801.61±3 07.51 903.28± 329.88 819.5± 373.40 963.10± 216.05a 909.50± 265.95a 923.50± 295.10a 897.60± 308.57a 0.68 0.001 0.58 ALT UI/L 36.25± 16.62 37.20± 17.32 42.67± 13.24 26.94± 9.97 57.21± 22.56 60.00± 31.60 72.00± 23.01 54.72± 21.49 76.76± 3.83 83.34± 35.39 92.69± 33.79 76.85± 30.25 56.74± 29.87ab 60.18± 34.24ab 70.23± 30.56a 45.42± 29.78b 0.04 <0.0001 0.95 TP g/dL 0.54± 0.06 0.58± 0.09 0.52± 0.07 0.49± 0.06 0.63± 0.06 0.58± 0.09 0.58± 0.04 0.57± 0.05 0.65± 0.08 0.64± 0.06 0.63± 0.05 0.61± 0.06 0.60± 0.08a 0.60± 0.08 ab 0.58± 0.07ab 0.55± 0.07b 0.02 <0.0001 0.26 Chol g/dL 4.07± 0.27 4.07± 0.27 4.33± 0.50 4.00± 0.00 4.21± 0.43 4.07± 0.27 4.17± 0.35 4.11± 0.33 4.07± 0.27 4.07± 0.27 4.17± 0.35 4.11± 0.33 4.12± 0.33a 4.07± 0.26a 4.22± 0.40a 4.07± 0.27a 0.24 0.87 0.70 30 minutes 2 hours 4 hours Treatment P-value CTRL IP6 FB1 FB1 + IP6 CTRL IP6 FB1 FB1+IP6 CTRL IP6 FB1 FB1+ IP6 CTRL IP6 FB1 FB1 + IP6 Treat2 Time Treat* Time ALP UI/L 41.65± 5.92 36.40± 4.41 41.72± 5.48 36.12± 5.77 41.88± 5.82 34.55± 5.30 43.08± 5.77 35.28± 5.36 41.18± 5.28 33.73± 8.27 41.17± 4.71 31.73± 4.82 41.57± 5.34 a 34.89± 5.95 b 41.99± 5.08 a 34.37± 5.37 b <0.0001 0.41 0.97 GGT UI/L 10.57± 0.96 10.60± 1.43 9.57± 1.34 10.05± 0.85 11.60± 1.39 11.83± 1.43 12.77± 4.56 11.45± 1.50 13.55± 2.11 12.75± 2.48 14.53± 2.26 12.12± 1.70 11.91± 1.94 a 11.72± 1.95 a 12.30± 3.56 a 11.20± 1.59 a 0.47 <0.0001 0.60 AST UI/L 352.23± 57.18 385.28± 68.90 355.1± 102.71 433.9± 112.69 647.0± 75.65 644.1± 122.48 528.0± 73.88 785.2± 217.67 789.7± 112.70 822.1± 174.26 673.4± 197.89 936.3± 181.53 596.35± 203.77ab 617.32± 221.0 ab 518.87± 184.8 b 714.57± 275.04 a 0.0007 <0.0001 0.69 ALT UI/L 13.67± 3.19 14.33± 4.24 32.35± 6.16 10.98± 5.30 20.05± 4.72 20.00± 4.12 29.20± 9.04 24.35± 9.85 25.00± 5.41 24.50± 6.14 36.68± 10.13 23.35± 6.15 19.57± 6.40 b 19.61± 6.30 b 32.84± 9.12 a 18.48± 9.82 b <0.0001 0.0006 0.36 TP g/dL 0.47± 0.05 0.42± 0.07 0.48± 0.04 0.43± 0.08 0.52± 0.04 0.50± 0.06 0.48± 0.07 0.47± 0.05 0.50± 0.06 0.52± 0.04 0.47± 0.05 0.48± 0.07 0.50± 0.04a 0.47± 0.07a 0.47± 0.05 a 0.47± 0.06 a 0.45 0.03 0.41 Chol g/dL 20.78± 5.43 20.67± 5.71 20.67± 5.71 20.67± 5.71 20.67± 5.71 20.67± 5.71 20.72± 5.74 21.45± 3.79 20.83± 5.81 20.67± 5.71 20.67± 5.71 23.00± 0.00 20.76± 5.31a 20.67± 5.37a 20.69± 5.38 a 21.70± 3.86 a 0.92 0.92 0.99 64 2.2 Morphological Assessment 1 2 No significant difference was observed in the lesion score among the treatments for 3 both EG1 and EG2. The mean values of histological score (EG1) were 0.9 ± 0.7 for control; 4 1.25 ± 1.5 for FB1; 1.4 ± 1.3 for IP6 and 1.65 ± 1.9 for FB1 + IP6 and for EG2 were 1.4 ± 0.73 5 for control; 2.0 ± 1.9 for FB1; 1.6 ± 0.8 for IP6 and 1.4 ± 0.9 for FB1 + IP6. For de EG1, the 6 histological aspects in the control explants indicated a well-organized hepatocyte trabeculae, 7 with mild hepatocyte cytoplasmic vacuolization. The main histological findings in explants 8 submitted to FB1 treatments were nuclear vacuolization and hepatocyte megalocytosis, whereas 9 IP6 and FB1+IP6 treatments remained similar to the control. For EG2 the histological aspects 10 for the treatments were similar to EG1 (Figure 1). 11 12 13 A B 65 1 2 3 Figure 1 - Histological aspects of pigs’ liver explants. A. Control group. Normal aspect of liver. 4 HE. Bar 100 m. B. Phytic acid (IP6) group. Normal aspect of liver. C and D. Fumonisin B1 5 group. Nuclear vacuolization of hepatocytes (thin arrow) (C) and hepatocyte megalocitosis 6 (dotted arrow) (D). HE. Bar 100 m. E. FB1 + IP6. Normal aspect of liver. HE. Bar 100 µm. F. 7 Liver lesion score in finishing pigs (EG1). Morphological score (AU—Arbitrary Units). G. 8 Liver lesion score in piglets (EG2) Morphological score (AU—Arbitrary Units). 9 a Means followed by the same letters do not difference significanty by ANOVA test (p<0,05). 10 11 12 2.3 Oxidative Stress Evaluation 13 14 2.3.1 Experimental group 1 (EG1): finishing pigs 15 16 F C D E G 66 A significant increase in NBT levels was observed in the FB1 and FB1+IP6 groups when 1 compared to the other treatments. On the other hand, no difference among treatments occurred 2 in TBARS levels (Figure 2). Concerning the antioxidant capacity, significant differences were 3 observed in GSH and ABTS levels. Exposure to FB1 induced a significant increase (112%) in 4 endogenous GSH levels compared to the IP6 group, whereas the incubation with FB1+IP6 5 produced a decrease in GSH levels (76.3%) compared to the FB1 group (Figure 2). Increased 6 levels of ABTS (95.2%) were observed in the IP6 group compared to the control and FB1 groups 7 (Figure 2). 8 9 Con tro l IP6 FB1 FB1+ IP6 Con tro l IP6 FB1 FB1+ IP6 10 Figure 2 - Effects of fumonisin (FB1) and phytic acid (IP6) on liver oxidative stress in EG1. 11 Explants exposed to control treatment ( ); IP6 (5mM) ( ); FB1 (100μM) ( ) and FB1 12 (100 µM) plus IP6 (5 mM) ( ). Lipid peroxidation and superoxide anion production. A. 13 Thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS). B. Nitroblue tetrazolium (NBT). Liver 14 antioxidant defense. C. Free-radical scavenging ability (ABTS). D. Ferric reducing ability 15 potential (FRAP). E. Reduced glutathione (GSH). 16 ab Means followed by different letters indicate statistical significance by ANOVA test ( p<0,05). 17 18 19 2.3.2 Experimental group 2 (EG2): Piglets 20 21 Following exposure to FB1 (100L) for 4 h intracellular reactive species (iROS) were 22 measured. Overall, these results indicate that FB1 caused increased ROS that were counteracted 23 by engaging the antioxidant defense. The liver explants exposed to FB1 showed a significant 24 increase in endogenous GSH levels compared to the control (133.3%). The presence of IP6 with 25 FB1 induced a decrease in GSH levels 35.7% compared to the FB1 group (Figure 3). Data 26 A B D C E 67 indicate that pre-treatment with IP6 did not differ statistically for FRAP, ABTS, NBT and 1 TBARS in cellular antioxidant capacity and oxidative response in liver explants. 2 Con tro l IP6 FB1 FB1+ IP6 TB AR S O D A 53 5/m g Pr ot ei n) 3 Con tro l IP6 FB1 FB1+ IP6 Contr ol IP6 FB1 FB1+IP6 4 Figure 3 - Effects of fumonisin FB1 (FB1) and phytic acid (IP6) on liver oxidative stress in the 5 EG2. Explants exposed to control treatment ( ); IP6 (5mM) ( ); FB1 (100M) ( ) and 6 FB1 (100 µM) + IP6 (5 mM) ( ). Lipid peroxidation and superoxide anion production. A. 7 Thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS). B. Nitroblue tetrazolium (NBT). Liver 8 antioxidant defense. C. Free-radical scavenging ability (ABTS). D. Ferric reducing ability 9 potential (FRAP). E. Reduced glutathione (GSH). 10 ab Means followed by different letters indicate statistical significance by ANOVA test ( p<0,05). 11 3 Discussion 12 Pigs are considered an adequate experimental model due to the anatomical and 13 physiological similarity with the human species and other mammals [23]. The efficacy of the 14 explant model has already been demonstrated in other organs [19, 26]; however, there is no data 15 on the efficacy of the technique in liver fragments. 16 During the 4-hour period, the liver tissue was preserved, allowing the analysis. Prior 17 to this study, the morphology of this tissue was compared between 0 hours (no incubation) and 18 4 hours of incubation in the control group and no significant difference between the groups 19 were observed (data not shown). Considering tissue maintenance during incubation, explants 20 were exposed to different treatments, including a well-known hepatotoxic mycotoxin. 21 Histological analysis showed mild changes in explants submitted to FB1, meanwhile, the mean 22 lesion score remained similar in all treatments. With these data, it is possible to infer that the 23 morphological and biochemical aspects indicate that the ex vivo model was suitable for 24 D A C B E 68 experimentation. The absence of significant differences between these groups may be due to 1 the short incubation time or the mode of exposure (direct contact), as liver histological changes 2 have already been demonstrated as a consequence of fumonisin administration [27]. 3 Fumonisins cause hepatic injury in all species regardless the route of administration. 4 In pigs, morphologic alterations were observed following ingestion (≥23ppm) or intravenous 5 administration [28]. Acute hepatic changes include disorganization of hepatic cords, 6 hepatocellular vacuolation, megalocytosis, apoptosis, necrosis, and cell proliferation [1]. In this 7 study, after 4h of exposure to FB1 the explants exhibited mainly hepatocyte nuclear and 8 cytoplasm vacuolization, megalocytosis, inflammatory infiltrate and apoptosis, agreeing with 9 the effects of fumonisin B1 in murine liver included apoptotic hepatocytes and occasional 10 mitotic figures scattered throughout the liver tissue with inflammatory changes characterized 11 by anisocytosis and cytoplasmic vacuolation [29]. 12 Another aim of this study was to assess biochemical parameters of liver lesion and 13 function in this model. First, we aimed to analyze liver injury and cholestasis indicators, and 14 second the liver function. Interestingly, the values for the liver enzymes GGT and ALT obtained 15 in the supernatant were similar to serum values for pigs (GGT: 10-60 UI/L and ALT: 31-58 16 UI/L). For the other parameters (ALP, AST, total protein and cholesterol) the values diverged 17 [30]. In regard to the period of incubation, the exposure of liver explants to FB1 induced a 18 significant increase in three different parameters (ALP, AST and ALT enzymes) over the time, 19 indicating a hepatotoxic effect. Changes in serum total bilirubin, ALP, AST, GGT, and 20 cholesterol have been associated with fumonisins chronic intoxication in pigs in vivo models 21 [31]. 22 For the EG1 (finishing pigs), there was a reduction in the enzymatic activity of ALT 23 in the FB1 plus IP6 group compared to the control and FB1 group. For EG2 (piglets), there was 24 a reduction in activity in the control groups, IP6 and FB1 plus IP6, compared with FB1 group. 25 This enzyme, as well as ALT, when measured in swine have little diagnostic value, due to the 26 low tissue concentration in this species, but due to its increase, it is suggested a more intense 27 lesion without histological detection or secondary elevation of synthesis following an intense 28 stimulus [32, 33]. Previous studies suggested that hepatic transaminases increase 12-72 hours 29 after injury, and the time factor (4h) may be one of the causes of enzyme elevation [34, 35]. 30 In addition to these data, a significant reduction was observed in IP6 and FB1 + IP6 31 group compared to FB1 in ALP enzymes for both experimental groups (EG1 and EG2). This 32 69 result suggests a protective effect of IP6 in the liver, since these enzymes are related to liver 1 lesion. A beneficial effect of IP6 was previously reported in intestinal explants exposed to FB1 2 [19], however, to the best of author's knowledge there is no data regarding the use of fumonisins 3 and phytic acid in liver explants. Since IP6 is an antioxidant, it may be the mechanism of this 4 substance against mycotoxins, however, the mechanism of IP6 against mycotoxins is not yet 5 understood [21]. 6 That in all domestic species AST activity is high in the liver, so in acute or chronic liver 7 injury the plasma concentration of AST will be high [36]. The increase in the enzymatic activity 8 of AST (EG1) occurred in the FB1 plus IP6 group compared to the FB1 group. The incubation 9 of tissues with high metabolism for periods of more than four hours induces loss of tissue 10 viability due to prolonged hypoxia [37]. Increase in hepatic transaminases 12-72 hours after 11 injury, and the time factor may be one of the causes of enzyme elevation [34, 30]. 12 The morphological and biochemical results indicate that the ex vivo model was suitable 13 for experimentation. Previous work has shown that fumonisin B1 increases the susceptibility to 14 lipid peroxidation due to oxidative stress [38]. Analysis for oxidative stress involves radical 15 generation (resulting in lipid peroxidation) and depletion of antioxidant compounds. For the 16 finishing pigs, a significant increase in NBT levels was observed in FB1 and FB1+IP6 groups 17 compared to control and IP6. NBT is associated with free radical generation [39] indicating the 18 potential of fumonisins to induce oxidative stress. Similarly, human hepatoma cells exposed to 19 FB1 exhibited increased levels of reactive oxygen species [42]. The exposure to mycotoxins 20 probably induced an increase in cytoplasmic and mitochondrial permeability, which may be 21 associated with ROS generation and resulting lipid peroxidation, as observed in vitro [12] and 22 in vivo [6,9]. On the other hand, the addition of IP6 induced no protective effect in NBT levels 23 compared to FB1. The antioxidant response capacity was evaluated through ABTS, FRAP and 24 GSH levels. An increase in ABTS levels was observed in IP6 group compared to other 25 treatments. Likely, GSH levels increased in FB1 compared to IP6 and FB1+IP6. 26 For the piglets, FB1 demonstrated effects only for GSH. The exposure to mycotoxins 27 probably induced an increase in cytoplasmic and mitochondrial permeability, which may be 28 associated with ROS generation and resulting lipid peroxidation, as observed in vitro [41, 16] 29 and in vivo [12, 13], but there was no difference (p> 0.05) in the lipid peroxidation (TBARS) 30 test, comparing the control and treated with FB1 group. The GSH level incresed after FB1 31 exposure. 32 70 Controversial results were reported in the literature. Recently, increased levels of GSH, 1 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) were reported 2 in hepatoma cells treated with FB1 [39]. Mice and rats fed fumonisin-diets also presented 3 increased levels of GSH in liver and kidney [10,42]. However, reductions in these same 4 enzymes were seen in other studies [9,11]. The elevation of GSH can be justified by the high 5 hepatic antioxidant capacity and the liver being considered an organ with great regeneration 6 capacity. Glutathione (GSH) together with two enzymes, glutathione peroxidase (GPx or GSH-7 Px) and glutathione reductase (GR or GSH-Rd), and the presence of selenium in the enzyme 8 (selenecysteine) an antioxidant in the body. This system also catalyzes the dismutation of 9 hydrogen peroxide in water and oxygen, with glutathione operating in cycles between its 10 oxidized form and its reduced form [15]. 11 The mechanisms of action of oxidative stress induced by FB1 include mitochondrial 12 injury, activation of caspase-3 [40]. The oxidative stress induced by FB1 occurs indirectly via 13 the intracellular accumulation of sphingolipids [41], a toxic mechanism with slower progression 14 at the ribosomal level. IP6 promoted a significant decreased in GSH level and antioxidant 15 capacity in the liver explants compared exposed to FB1, IP6's antioxidant capacity may have 16 occurred. In agreement, the ability of IP6 to protect cells against oxidative stress has been 17 associated with the inhibition of ROS generation, increase of GSH level, CAT, GPx, and SOD 18 content, and decrease of lipid peroxidation (MDA) in hepatocarcinogenesis studies in rats [42, 19 43, 44]. The beneficial effects of IP6 against FB1 toxicity are probably associated with its 20 antioxidant capacity, mainly its ability to inhibit the Fenton reaction and formation of hydroxyl 21 radicals [19]. 22 The development of mechanisms that reduce the toxic effects of mycotoxins such as IP6 23 effectively contributes to one health, as exposure to mycotoxins is frequent and significantly 24 affects the health of humans and animals [41]. Moreover, the data from this work can be 25 extrapolated to human medicine, since swine liver metabolism is similar to that of human 26 organs [23]. The present results demonstrate that the protective effect of IP6 on the liver 27 oxidative stress is associated with its capacity to mitigate lipid peroxidation and increase the 28 antioxidant capacity of the tissue. 29 4 Conclusions 30 71 The results of the present study indicate that liver explants are appropriate for 1 assessing the effects of toxic substances on cell integrity. From the biomarkers evaluated in this 2 model it was found that FB1 caused injury early and effectively. In conclusion, the hepatic ex 3 vivo model provides an opportunity to evaluate both tissue morphology and biochemical 4 aspects. However, more studies are needed to elucidate the mechanisms and intracellular 5 signaling pathways that trigger oxidative stress induced by this mycotoxin in the liver. Phytic 6 acid exerts beneficial effects upon the liver, modulating the changes induced by FB1 and 7 protecting cells against oxidative stress. In this way, the use of explants seems to be the 8 promising model for toxicological studies, besides contributing with the 3 R's of the animal 9 experimentation. 10 5 Material and Methods 11 5.1 Animals and Reagents (FB1 and Phytic Acid) 12 13 Six 40-day-old (half-castrated males and half females) swinelets (nearly 13.0 Kg) and 9 14 pigs 120-day-old (half-castrated males and half females) pigs from slaughterhouses were used 15 in the present study. The FB1 (MW: 721.83; Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, 16 USA) were dissolved in ultrapure water at final concentrations of 100 µM for FB1, and stored 17 at 4◦C. The phytic acid salt (MW: 819; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) was dissolved in 18 distilled water to the concentration of 15 mM, and the pH adjusted to 7.2. The solution was 19 stored at −20◦C before dilution in the explant culture media. The IP6 (5 mM) and FB1 (100 µM) 20 concentrations used were chosen according to previous studies [19, 45]. 21 5.2 Ex Vivo Experimental Model 22 23 The experimental procedures on animals were approved by the ethics commission, 24 (OF. CIRC. CEUA Nº 15/2019 - 13812.2017.19). The piglets were euthanized (acepromazine 25 1%, sodium pentobarbital 40 mg/Kg and KCl 15%) and fragments of the liver were sampled, 26 washed with a buffer solution. The explants submitted into the following treatments: control 27 (Ctrl 4), fumonisin B1 (100 μM), phytic acid (5 mM) and fumonisin B1 (100 μM) + phytic acid 28 (5 mM). For each treatment, six explants were sampled using a microtome razor (8 mm), 29 resulting in 24 explants/ animal totaling 216 explants for the EG1 and 144 explants for the EG2. 30 The explants were incubated in six well plates (two explants/well) containing 1mL of the agar 31 72 (1,5%) and filled with 5mL of DMEM (Gibco-BRL Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 1 supplemented with penicillin/streptomycin (1.25 µL/mL, Gibco-BRL Life Technologies, 2 Carlsbad, CA, USA), fetal bovine serum (100 µL/mL, Invitrogen, São Paulo, SP, Brazil) and 3 glutamine (0.4 µL/mL, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Then, the explants were incubated 4 for 4 hours in an incubator at 37 ◦C in a chamber under controlled conditions with orbital 5 shaking. Supernatant (200 µL) was sampled from each well at half, two and four hours for 6 biochemical analysis (Figure 4). After a total period of incubation, the explants (three from each 7 treatment) were fixed in 10% neutral buffered formalin solution, dehydrated in alcohols and 8 embedded in paraffin for histological. Two explants were immediately frozen in liquid nitrogen 9 and posteriorly stored at −80◦C for the quantification of reduced glutathione (GSH), 10 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), nitroblue tetrazolium (NBT), 2,2’-azino-bis-11 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) and ferric-reducing antioxidant power 12 (FRAP) assays. 13 14 Figure 4 - A. Supernatant harvest for biochemical measurements. B. Collection of liver 15 explants after 4-hours for histopathological processing, in order to verify the different injury 16 scores. 17 18 5.3. Histological evaluation 19 20 Following fixation, the explants were dehydrated in increasing alcohol solutions and 21 embedded in paraffin wax. Tissue sections (5 µm) were stained with hematoxylin–eosin for 22 histopathological evaluation. The histological sections were analyzed under a lesion score. The 23 criteria evaluated were trabecular disorganization, cytoplasmic and nuclear vacuolar 24 degeneration, inflammatory infiltrate, cellular megalocytosis, apoptosis and necrosis, and these 25 B A 73 were scored according to the severity of the lesion, in zero (0) for unchanged tissues, one (1) 1 for mild or (2) for moderate changes and three (3) for severe alterations. The criteria of 2 cytoplasmic and nuclear vacuolar degeneration, since they present an important factor in the 3 development of the lesion, when present had the score multiplied by two and the criterion of 4 necrosis because it is the most advanced stage of the lesion, multiplied by three. After the 5 evaluation of the established criteria, the sum of all the scores was done in order to obtain the 6 lesion score, allowing a comparison between the experimental groups. 7 5.3 Biomarkers assessment of lesion and liver function 8 9 Biochemical evaluation of the supernatant was carried out at half, two and four hours 10 of incubation. The aim was to measure the levels of enzymes indicating injury, cholestasis and 11 liver function. The dosage of alkaline phosphatase (ALP) and -glutamyltransferase (GGT) 12 (induction enzymes); alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) 13 (extravasation enzymes) were measured by enzyme activity test of high sensitivity and for 14 evaluation of function, cholesterol and total protein by means of a colorimetric assay. These 15 tests were processed by the Dimension Clinical Chemistry System (Siemens, Germany) 16 according to the manufacturer standardized technique. 17 18 5.4 Oxidative stress response analysis 19 20 Liver samples were also collected to determine lipid peroxidation and superoxide anion 21 production through the levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and nitroblue 22 tetrazolium (NBT) reduction assays, respectively. In addition, the antioxidant capacity was 23 evaluated through the reduced glutathione (GSH), ferric reducing ability potential (FRAP) and 24 free-radical scavenging ability (ABTS). The oxidative stress response was measured in the 25 different treatments after four hours of incubation. 26 27 5.5.1 Determination of antioxidant capacity by the reduced glutathione (GSH), ferric-reducing 28 ability potential (FRAP) and free-radical scavenging ability (ABTS) assay 29 30 The collected liver samples were frozen at -80 °C. These samples were processed and 31 homogenized with 500 μl of 1.15% KCl, then centrifuged (200 x g, 10min, 4ºC) and with the 32 74 resulting supernatant the total antioxidant capacity of the liver was assessed by FRAP and 1 ABTS assays [46]. 2 5.5.1.1 GSH Levels Measurement 3 4 Glutathione (GSH) is a thiol tripolide, which has several biological functions, such as 5 acting as an antioxidant [47]. The intracellular concentration of GSH is an indicator of oxidative 6 stress. Levels of glutathione (GSH) in tissue samples were determined using a 7 spectrophotometric method previously described [48]. Frozen liver samples were homogenized 8 using Tearor Tissor (Bjospec, São Paulo, SP, Brazil) in cold 0.02M EDTA buffer. The 9 homogenate was treated with 50% trichloroacetic acid and centrifuged (1500 x g, 15 min), and 10 to the supernatant 0.4 M Tris-HCl (pH 8.9) and 10 mM dithiobisnitrobenzoic acid were added. 11 After 5 min, the absorbances were read at 412 nm (Multiskan GO Microplate 12 spectrophotometer, ThermoScientific, Vantaa, Finland). A standard curve was prepared using 13 different concentrations of GSH, in addition to the other reagents mentioned above. The results 14 were presented as nmol GSH / mg protein. 15 5.5.1.2. FRAP and ABTS Assays 16 17 The ability to reduce the radical cation 2,2'-azinobis- (3-ethylbenzothiazoline-6-18 sulfonate; ABTS +) (ABTS assay) and iron-reducing antioxidant power (FRAP) was evaluated 19 in liver explants for different treatments. The FRAP method is based on the production of Fe2+ 20 ion (ferrous form) from the reduction of the Fe3+ion (ferric form) present in the tripyridyltriazine 21 complex (TPTZ) by means of acidic antioxidants. This assay provides a very useful "total" 22 antioxidant concentration [17]. For the FRAP assay, 15 μl of the supernatant was mixed with 23 45 μl of deionized water and 200 μl of freshly prepared FRAP reagent (Sigma Chemical Co., 24 St. Louis, MO, USA). The mixture was then incubated at 37º C for 30 min and the absorbance 25 was measured at 595 nm (GO Multiskan microplate spectrophotometer, ThermoScientific, 26 Vantaa, Finland). The ABTS procedure is based on the ability of antioxidant molecules to 27 reduce ABTS cation radical [49]. For the ABTS assay, the ABTS solution (Sigma Chemical 28 Co., St. Louis, MO, USA) was diluted with phosphate buffered saline at pH 7.4 for an 29 absorbance of 0.80 at 730 nm. Then, 200 μl of diluted ABTS solution was mixed with 15 μl of 30 supernatant. After 6 minutes the absorbance was measured at 730 nm (Multiskan GO, Thermo 31 75 Scientific). A standard curve was prepared using different concentrations of Trolox (1.5-30 1 μmol / l, final concentrations). The protein levels in the samples were used for normalization of 2 the data and the results were expressed as nmol of the Trolox equivalent (Sigma Chemical Co., 3 St. Louis, MO, USA) per milligrams of protein in both assays. 4 5.5.2. Determination of the oxidative response by nitroblue tetrazolium (NBT) and 5 thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) assays 6 7 5.5.2.1 Nitroblue tetrazolium (NBT) 8 9 The superoxide anion production was determined by the reduction of the redox dye 10 nitroblue tetrazolium (NBT) [50]. The tissues were homogenized with 500 μl of 1.15% KCl 11 and aliquots of 50 μl of homogenate were transferred to a 96-well plate, followed by the addition 12 of 100 μl of NBT solution (1 mg/mL), and maintained at 37◦C in a warm bath for 1 h. The 13 supernatant was carefully removed, and the formazan precipitated was then solubilized by 14 adding 120 μl of 2M KOH and 140 μl of DMSO. The optical density was measured by 15 microplate spectrophotometer (Multiskan GO, Thermo Scientific) at 600 nm. The protein levels 16 in the samples were used for data normalization and the results were presented as NBT 17 reduction (optical density [OD] per milligram of protein). 18 5.5.2.2. Lipid Peroxidation Measurement (TBARS) 19 20 Lipid peroxidation in the liver explants was assessed by determining TBARS levels, 21 using an adapted method [49]. For this assay, trichloroacetic acid (10%) was added to the 22 homogenate to precipitate proteins, followed by centrifugation (1000 × g, 3 min, 4º C). The 23 protein-free supernatant was separated and mixed with thiobarbituric acid (0.67%). The mixture 24 was incubated for 15 min in water bath (100˚C) and transferred to an ice bath. This procedure 25 measures the malondialdehyde (MDA) an intermediate product of lipid peroxidation, 26 determined by the difference between absorbance at 535 and 572 nm using a microplate 27 spectrophotometer reader. The result was presented as TBARS (OD A535-A572/mg of 28 protein). 29 76 5.6. Statistical Analysis 1 2 The data (mean ± standard error) were analyzed using the free software Sisvar 5.6 [51]. 3 The histological score was compared by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by 4 Tukey’s test for multiple comparisons and liver biomarkers were analyzed using factorial 5 ANOVA, followed by the Tukey test (p values ≤ 0.05). The effect of treatments on the oxidative 6 stress response (GSH, TBARS, ABTS, and FRAP assays) was analyzed by ANOVA, followed 7 by Tukey’s test (p values ≤ 0.05), using the statistical software GraphPad Prism 6.01 (GraphPad 8 Software Inc., La Jolla, CA, 38 USA). 9 Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. 10 References 11 1. Sabino, M. Mycotoxins in food. In: OGA, S. Fundamentos de Toxicologia. São Paulo: 12 Atheneu Editora, 1996, 461-71. 13 2. Brera, C.; Miraglia, M.; Colatosti, M. Evaluation of the Impact of Mycotoxins on Human 14 Health: Sources of Errors. Microchemical Journal.1998, 59, p. 45–49. 15 16 3. Zain, Mohamed E. “Impact of Mycotoxins on Humans and Animals.” Journal of Saudi 17 Chemical Society 2011, 15, 2: 129–44. https://doi.org/10.1016/j.jscs.2010.06.006. 18 4. Castro, I. C. Di; Oliveira, H. F. De; Mello, H. H. C.; Mascarenhas, A. G. Micotoxinas na 19 produção de suínos Mycotoxins in swine production. Revista Portuguesa de Ciências 20 Veterinárias. 2015, 110, 6–13. 21 22 5. Kolf-Clauw, M.; Castellote, J.; Joly, B.; Bourges-Abella, N.; Raymond-Letron, I.; Pinton, P.; 23 Oswald, I. P. Development of a swine jejunal explant culture for studying the gastrointestinal 24 toxicity of the mycotoxin deoxynivalenol: histopathological analysis. Toxicology in Vitro 25 2009, v. 23, n. 8, p. 1580-1584. 26 27 6. Haschek, W. M.; Motelin, G.; Ness, D. K.; Harlin, K. S.; Hall, W. F.; Vesonder, R. F.; 28 Peterson, R. E.; Beasley, V. R. Characterization of fumonisin toxicity in orally and 29 intravenously dosed swine. Mycopathologia. 1992, 117, 83–96. 30 31 7. Stockmann-Juvala, H.; Savolainen, K. A review of the toxic effects and mechanisms of action 32 of fumonisin B1. Human & Experimental Toxicology. 2008, 27, 799–809. 33 34 8. Haschek, W. M.; Gumprecht, L. A.; Smith, G.; Tumbleson, M. E.; Constable, P. D. 35 Fumonisin toxicosis in swine: An overview of porcine pulmonary edema and current 36 perspectives. Environmental Health Perspectives. 2001, 109, 251–257. 37 38 77 9. Hentz, S. S.; Showker, J. L.; Meredith, F. I.; Riley, R T. Inhibition of sphingolipid 1 biosynthesis decreases phosphorylated ERK2 in LLC-PK1 cells. Food and Chemical 2 Toxicology. 2005, 43, 123–131. 3 10. Osselaere, A.; Santos, R.; Hautekiet, V.; Backer, P.D.; Chiers, K.; Ducatelle, R.; Croubels, 4 S. Deoxynivalenol impairs hepatic and intestinal gene expression of selected oxidative stress, 5 tight junction and inflammation proteins in broiler chickens, but addition of an adsorbing agent 6 shifts the effects to the distal parts of the small intestine. PLoS ONE 2013, 7 8 11. Abbes, S.; Ben Salah-Abbes, J.; Jebali, R.; Younes, R.B.; Queslati, R. Interaction of 9 Aflatoxin B1 and fumonisin B1 in mice causes immunotoxicity and oxidative stress: Possible 10 protective role using lactic acid bacteria. Journal Immunotoxicol. 2016, 13, 46–54. 11 12 12. Li, D.; Ye, Y.; Lin, S.; Deng, L.; Fan, X.; Zhang, Y.; Deng, X.; Li, Y.; Haikuo, M.H.Y. 13 Evaluation of deoxynivalenol-induced toxic effects on DF-1 cells in vitro: Cellcycle arrest, 14 oxidative stress, and apoptosis. Environ Toxicology Pharmacology. 2014, 37, 141–149. 15 16 13. Domijan, A.M.; Gajski, G.; Jovanovic, I.N.; Geric, M.; Garaj-Vrhovac, V. In vitro 17 genotoxicity of mycotoxin ochratoxin A and fumonisin B (1) could be prevented by sodium 18 copper chlorophylin-implication to their genotoxic mechanism. Food Chemical. 2015, 170, 19 455–462. 20 21 14. Bracarense, A.P.F.R.L.; Lucioli, J.; Grenier, B.; Pacheco, G.D.; Molls, W.-D.; Schtzmayr, 22 G.; Oswald, I.P. Chronic ingestion of deoxynivalenol and fumonisin, alone or in interaction, 23 induces morphological and immunological changes in the intestine of swinelets. Br. J. Nutr. 24 2012, 107, 1776–1786. 25 15. Martínez-Cayuela, M. Oxygen free radicals and human disease. Biochemie 1995, 77, 147-26 161. 27 16. Grenier, B.; Bracarense, A.P.F.L.; Schwartz, H.E.; Trumel, C.; Cossalter, A.M.; 28 Schatzmayr, G.; Oswald, I.P. The low intestinal and hepatic toxicity of hydrolyzed fumonisin 29 B1 correlates with its inability to alter the metabolism of sphingolipids. Biochem. Pharmacol. 30 2012, 83, 1465–1473. 31 17. Wang, X.; Wu, Q.; Wan, D.; Liu, Q.; Chen, D.; Liu, Z.; Matinez-Larranaga, M.R.; Martinez, 32 M.A.; Anadon, A.; Yuan, Z. Fumonisins: Oxidative stress-mediated toxicity and metabolism in 33 vivo and in vitro. Arch. Toxicol. 2016, 90, 81–101. 34 18. Antolovich, M, P. D.; Prenzler, E.; Patsalides, S.; McDonald, and K. Robards. Methods for 35 testing antioxidant activity. The Analyst 2002, 127, 183–198. 36 19. Da Silva, E. O.; Gerez, J. R.; do Carmo Drape, T.; Bracarense, A. P. F. R. L. Phytic acid 37 decreases deoxynivalenol and fumonisin B1-induced changes on swine jejunal explants. 38 Toxicology Reports. 2014, 1, 284–292. 39 40 20. Graf, E. Antioxidant functions of phytic acid. Free Radical Biology and Medicine. 1990, 8, 41 61–69. 42 43 78 21. Pacheco, G.D.; Silva, C.A.; Pinton, P.; Oswald, I.P.; Bracarense, A.P. Phytic acid protects 1 porcine intestinal epithelial cells from deoxynivalenol (DON) cytotoxicity. Exp. Toxicol. 2 Pathol. 2012, 64, 345–347. 3 22. Hou, Y.-J.; Zhao, Y.-Y.; Xiong, B.; Cui, X.-S.; Kim, N.-H.; Xu, Y.-X.; Sun, S.-C. 4 Mycotoxin-Containing Diet Causes Oxidative Stress in the Mouse. PLoS ONE 2013, v. 8, n. 3, 5 p. e60374, 28 mar. . 6 23. Guilloteau, P.; Zabielski, R.; Hammon, H. M.; Metges, C. C. Nutritional programming of 7 gastrointestinal tract development. Is the swine a good model for man? Nutrition Research 8 Reviews 2010, Germany, v. 23, n. 1, p. 4-22. 9 24. Swindle, M. M.; Smith, A. C. Comparative and physiology of the swine. Scandinavian 10 Journal of Laboratory Animal Science 1998, v. 25, p. 11- 21. Supplement 1. 11 25. Basso, K.M.; Bracarense, A.P.F.R.L. “Tissue Explants: A Rediscovered Model in Animal 12 Experimentation” Semina: Ciências Agrárias 2013, 34, no. 6Supl2: 3951. 13 https://doi.org/10.5433/1679-0359.2013v34n6Supl2p3951. 14 15 26. Bansal, D.; Ave, P.; Kerneis, S.; Frileux, P.; Boche, O.; Baglin, A. C.; Dubost, G.; Leguern, 16 A. S.; Prevost, M. C.; Bracha, R.; Mirelman, D.; Guille, N. N.; Labruye, R.E. An ex-vivo human 17 intestinal model to study Entamoeba histolytica pathogenesis. PLOS Neglected Tropical 18 Diseases, New York. 2009, 3, 1-11. 19 20 27. Gumprecht, L. A.; Beasley, V. R.; Weigel, R M.; Parker, H1 M.; Tumbleson, M. E.; Bacon, 21 C. W.; Meredith, F. L.; Haschek, W. M. Development of Fumonisin-Induced Hepatotoxicity 22 and Pulmonary Edema in Orally Dosed Swine: Morphological and Biochemical Alterations. 23 Toxicologic Pathology, 1998, 26, 777–788. 24 28. Harrison, L.R.; Colvin, B.M; Greene, J.T; Newman, L. E.; Cole Jr. Pulmonary edema and 25 hydrothorax in swine produced by fumonisin B1, a toxic metabolite of Fusarium moniliforme. 26 Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 1990, 2, 217–221. 27 28 29. Sharma, P. R.; Bhandari, N.; He Q. He, Riley, T. R.; Voss, A. K. Decreased fumonisin 29 hepatotoxicity in mice with a targeted deletion of tumor necrosis factor receptor 1. Toxicology 30 2001, v.159, 69-79. 31 32 30. Kaneko, J. J. Clinical Biochemistry of Domestic Animals, ed. by J. J. Kaneko, Academic 33 Press, New York. 2008, 385. 34 35 31. Casteel, S.W.; Turk, J. R.; Rottinghaus, G.E. Chronic effects of dietary fumonisin on the 36 heart and pulmonary vasculature of swine. Fundamental and Applied Toxicology. Orlando. 37 1994, 23, 518-524. 38 39 32. Meyer, Coles e Rich. Veterinary laboratory medicine: Interpretation and diagnosis. 40 Publishing company ROCA, p. 3-6, 1995. 41 33. Rico, A. G.; Braun, J. P.; Benard, P. Tissue and blood gamma-glutamyltransferase 42 distribution in the pig. Research in Veterinary Science. 1977, 23. 43 79 34. Suzuki, H.; Riley T. R. and Sharma P. R. Inducible nitric oxide has protective effect on 1 fumonisin B1 hepatotoxicity in mice via modulation of sphingosine kinase, Toxicology. 2007, 2 229, 42–53. 3 4 35. Sharma, P. R.; Bhandari, N.; He Q. He, Riley, T. R.; Voss, A. K. Decreased fumonisin 5 hepatotoxicity in mice with a targeted deletion of tumor necrosis factor receptor 1. Toxicology. 6 2001, 159, 69-79. 7 8 36. Tennant, B. C. Hepatic function. In: Kaneko, J. J.; Harvey, J. W.; Bruss, M. L. Clinical 9 biochemistry of domestic animals. 5td ed. London: Academic Press, 1997, 327-352. 10 11 37. Randall, K. J.; Turton, J.; Foster, J. R. Explant culture of gastrointestinal tissue: a review 12 of methods and applications. Cell Biology and Toxicology 2011, London, v. 27, n. 4, p. 267-13 284. 14 38. Abel, S.; Gelderblom, W.C.A. “Oxidative Damage and Fumonisin B1-Induce Toxicity in 15 Primary Rat Hepatocytes and Rat Liver in Vivo.” Toxicology. 1998, 131, 121–31. 16 39. Hou, Y.-J.; Zhao, Y.-Y.; Xiong, B.; Cui, X.-S.; Kim, N.-H.; Xu, Y.-X.; Sun, S.-C. 17 Mycotoxin-Containing Diet Causes Oxidative Stress in the Mouse. PLoS ONE. 2013,8. 18 19 40. Arumugam, T.; Pillay, Y.; Ghazi, T.; Nagiah, S.; Abdul, N.S.; Chuturgoon, A. A. Fumonisin 20 B1-induced oxidative stress triggers Nrf2-mediated antioxidant response in human 21 hepatocellular carcinoma (HepG2) cells. Mycotoxin Research. 2019, 35, 99-109. 22 23 41. Halliwell, B.; Clement, M. V.; Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. Febs 24 Letters. 2000, 486, 10-13. 25 26 42. Lee, H.J.; Lee, S.A.; Choi, H. Dietary administration of inositol and/or inositol-6-phosphate 27 prevents chemically-induced rat hepatocarcinogenesis. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2005, 6, 41–28 47. 29 43. Foster, S.R.; Dilworth, L.L.; Thompson, R.K.; Alexander-Lindo, R.L.; Omoruyi, F.O. 30 Effects of combined inositol hexakisphosphate and inositol supplement on antioxidant activity 31 and metabolic enzymes in the liver of streptozotocin-induced type 2 diabetic rats. Chem. Biol. 32 Interact. 2017, 275, 108–115. 33 44. Gelderblom, W.C.A., Snyman, S.D., Van der Westhuizen, L., Marasas, W.F.O. 34 Mitoinhibitory effect of fumonisin B1 on rat hepatocytes in primary culture. Carcinogenesis 35 1995,16, 625–631. 36 45. Basso, K.; Gomes, F.; Bracarense, A.P. Deoxynivanelol and fumonisin, alone or in 37 combination, induce changes on intestinal junction complexes and in E-cadherin expression. 38 Toxins 2013, 5, 2341–2352. 39 46. Pinho-Ribeiro, F. A., M. S. N. Hohmann, S. M. Borghi, A. C. Zarpelon, C. F. S. Guazelli, 40 M. F. 8 Manchope, R. Casagrande, and W. A. Verri. Protective effects of the flavonoid 41 hesperidin 9 methyl chalcone in inflammation and pain in mice: Role of TRPV1, oxidative 42 stress, cytokines 10 and NF-κB. Chemico-Biological Interactions 2015, 228, 88–99. 43 80 47. Lushchak, V. I. Glutathione Homeostasis and Functions: Potential targets for medical 47 1 interventions. Journal of Amino Acids 2012, 1–26. 2 48. Sedlak, J.; Lindsay, R. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups 3 in tissue with Ellman’s reagente. Anal Biochem. 1968, 25, 192–205. 4 49. Hohmann, M. S. N., R. D. R. Cardoso, F. A. Pinho-Ribeiro, J. Cresswineio, T. M. Cunha, 5 J. C. Alves-Filho, R. V da Silva, P. Pinge-Filho, S. H. Ferreira, F. Q. Cunha, R. Casagrande, 6 and W. A. Verri. 2013. 5-lipoxygenase deficiency reduces acetaminophen-induced 7 hepatotoxicity and 14 lethality. BioMed Research International 2013, 627046. 8 50. Fattori, V., S. M. Borghi, C. F. S. Guazelli, A. C. Giroldo, J. Cresswineio, A. J. C. 9 Bussmann, L. 32 Coelho-Silva, N. G. Ludwig, T. L. Mazzuco, R. Casagrande, and W. A. Verri. 10 Vinpocetine reduces diclofenac-induced acute kidney injury through inhibition of oxidative 11 stress, apoptosis, cytokine production, and NF-κB activation in mice. Pharmacological 12 Research 2017, 120, 10–22. 13 51. Ferreira, D. F. Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciência e Agrotecnologia. 14 2011, 35, 1039-1042. 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 81 8 CONCLUSÕES 1 2 3  A utilização deste modelo experimental é promissora para estudos 4 toxicológicos e os resultados do presente estudo indicam que os explantes 5 hepáticos de suínos são adequados para avaliar os efeitos de substâncias 6 tóxicas, mantendo a integridade celular no período de 4 horas e contribuiu com 7 os 3 R's da experimentação animal (Reduction, Replacement e Refinement), 8 pois utilizando tecidos de suínos de terminação, há redução do número de 9 animais na experimentação e com base no fato de que os suínos são 10 semelhantes aos humanos, os achados podem ser relevantes para esta 11 espécie. 12  Os biomarcadores hepáticos avaliados neste modelo mostraram que a FB1 13 (100M) promoveu incremento da atividade das enzimas hepáticas tanto para 14 o GE1 quanto para o GE2, possivelmente por aumentar a permeabilidade dos 15 hepatócitos. Porém para o acetaminofeno, os mecanismos de lesão hepática 16 são altamente complexos e muitos eventos intracelulares e extracelulares 17 estão envolvidos neste processo fisiopatológico, incluindo metabolismo do 18 acetaminofeno, estresse oxidativo mitocondrial, disfunção celular, inflamação, 19 além da regeneração hepática, que ainda precisam ser elucidados, utilizando 20 este modelo experimental. 21  O ácido fítico exerce efeitos benéficos sobre o explante hepático, modulando 22 as alterações induzidas pelo FB1 e acetaminofeno. Esses efeitos estão 23 associados a uma resposta ao estresse oxidativo, incluindo possível 24 capacidade antioxidante. 25  O aumento da capacidade antioxidante hepática (GSH) no GE2 em ambos os 26 experimentos, sugerem que leitões apresentam mecanismos de 27 desintoxicação dependentes de glutationa, superior aos suínos de terminação 28 (GE1) que tiveram aumento desta defesa antioxidante apenas com FB1, 29 comparada com IP6 e IP6+FB1. Para o GE2, com acetaminofeno, houve 30 elevação dos ensaios ABTS e FRAP, contribuindo também com a defesa 31 antioxidante. Suínos de terminação (GE1), foram mais susceptíveis a lesões 32 82 do que leitões (GE2), devido à elevação de NBT (tetrazólio de nitroazul) no 1 grupo FB1. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 83  ANEXOS 1 2 Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Londrina -UEL 3 4