SANDRA CRISTINA HEIM LONIEN INTERAÇÃO Trypanosoma cruzi-CÉLULAS DO SANGUE HUMANO ENRIQUECIDAS COM CÉLULAS DENDRÍTICAS: RELAÇÃO DA VIA CICLOOXIGENASE E INFECÇÃO Londrina 2017 SANDRA CRISTINA HEIM LONIEN INTERAÇÃO Trypanosoma cruzi-CÉLULAS DO SANGUE HUMANO ENRIQUECIDAS COM CÉLULAS DENDRÍTICAS: RELAÇÃO DA VIA CICLOOXIGENASE E INFECÇÃO Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Patologia Experimental da Universidade Estadual de Londrina para obtenção do título de Doutora em Patologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Phileno Pinge-Filho Co-orientador: Dr. Juliano Bordignon Londrina 2017 SANDRA CRISTINA HEIM LONIEN INTERAÇÃO Trypanosoma cruzi-CÉLULAS DO SANGUE HUMANO ENRIQUECIDAS COM CÉLULAS DENDRÍTICAS: RELAÇÃO DA VIA CICLOOXIGENASE E INFECÇÃO Tese apresentada ao Programa de Pós- graduação em Patologia Experimental da Universidade Estadual de Londrina, para obtenção do título de Doutora em Patologia Experimental. BANCA EXAMINADORA _______________________________________ Prof. Dr. Phileno Pinge Filho Universidade Estadual de Londrina - UEL _______________________________________ Prof. Dr. Fábio Henrique Kwasniewski Universidade Estadual de Londrina - UEL _______________________________________ Profª. Drª. Andressa de Freitas Mendes Dionísio Universidade Estadual de Londrina - UEL _______________________________________ Profª. Drª. Graziela Scalianti Ceravolo Universidade Estadual de Londrina - UEL ________________________________________ Profª. Drª. Renata Katsuko Takayama Kobayashi Universidade Estadual de Londrina - UEL Londrina, 01 de setembro de 2017. Dedico este trabalho ao meu esposo Geraldo e aos meus filhos Thiago e Ricardo, que tanto se sacrificaram para que eu pudesse concluir esse trabalho. AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu orientador Prof Dr Phileno Pinge Filho pela oportunidade e confiança a mim depositada, pela compreensão, pelo incentivo e dedicação. Ao meu co-orientador Dr Juliano Bordignon agradeço pelos ensinamentos sobre células dendríticas, pelo incentivo e carinho e pela enorme colaboração neste trabalho. À todos os doadores voluntários, cuja colaboração foi essencial para a execução deste trabalho. Ao Dr Guilherme Ferreira pelos ensinamentos sobre citometria de fluxo e pelas contribuições na realização deste trabalho. À Dra Priscylla Fanini Wowk pelo apoio e pelas contribuições neste trabalho. À Dra Aparecida Donizeti Malvezi pela ajuda valiosa nas leituras das lâminas dos ensaios de invasão. Aos colegas do Laboratório de Imunopatologia Experimental, agradeço a todos sem exceção. À todos que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. “Temos de fazer o melhor que podemos. Esta é a nossa sagrada responsabilidade humana.” Albert Eisntein LONIEN, Sandra Cristina Heim. Interação Trypanosoma cruzi-células do sangue humano enriquecidas com células dendríticas: relação da via ciclooxigenase e infecção. 2017. 104 f. Tese (Doutorado em Patologia Experimental) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2017. RESUMO Estima-se que cerca de 6 a 7 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente na América Latina, estão infectadas com Trypansosoma cruzi, o parasita que causa a doença de Chagas. Suspeita-se que as cepas virulentas de T. cruzi aproveitam as células dendríticas (DCs) para superar a resposta imune do hospedeiro e instalar, com sucesso, a infecção. Embora as DCs sejam caracterizadas por uma enorme diversidade funcional, não foi analisada a participação da ciclooxigenase (COX) e do adenosina monofosfato cíclico (cAMP) na interação DCs-T. cruzi. Em um trabalho desenvolvido anteriormente em nosso laboratório, foi descrito que os anti- inflamatórios não esteroidais (AINEs) como a aspirina e o celecoxibe inibem a invasão de T. cruzi em células cardíacas de ratos e promovem a modulação da resposta inflamatória. Explorando este mecanismo, populações de células mononucleares de sangue periférico humano enriquecidas com DC (DC-PBMCs) foram utilizadas como nosso modelo. Nossos resultados mostraram que o tratamento de DC-PBMCs com celecoxibe (CEL), um inibidor seletivo de ciclooxigenase-2 ou SQ 22,536, inibidor da adenilato ciclase, inibiu a infecção por T. cruzi. Nenhum efeito foi observado quando as células foram tratadas com aspirina (ASA, um inibidor não seletivo de COX-1 e COX-2) bem como foi independente da produção de óxido nítrico (NO). A expressão de moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 foram semelhantes em DC-PBMCs tratadas ou não com ambos os inibidores de COX. A infecção não estimulou a secreção de TNF- mas aumentou a produção de IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e NO pelas DC-PBMCs infectadas. O tratamento com ASA ou CEL não afetou a produção de TNF-, IL-6, IL-8, IL-10 e NO pelas DC-PBMCs infectadas, mas aumentou a produção de IL-1. Nossos resultados reforçam a ideia de que a COX-2 desempenha um papel fundamental no processo de invasão do T. cruzi, na resposta inflamatória inata e podem representar um alvo pertinente para o desenvolvimento de novos tratamentos para a doença de Chagas. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi. Citocinas. Células dendríticas. Aspirina. Celecoxibe. LONIEN, Sandra Cristina Heim. Interaction Trypanosoma cruzi- human blood cells enriched with dentritic cells: relationship of the via ciclooxigenase and infection. 2017. 104 p. Thesis (PhD in Experimental Pathology) – State University of Londrina, Londrina, 2017. ABSTRACT About 6 to 7 million people worldwide, mostly in Latin America, are estimated to be infected with Trypansosoma cruzi, the parasite that causes Chagas’ disease. It seems that T. cruzi virulent strains take advantage of susceptible dendritic cells (DCs) to overcome host immune response and successfully install the infection. Although DCs are characterized by a great functional diversity, the participation of cyclooxygenase (COX) and cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in the DC-T. cruzi interaction was not analyzed. In a study previously developed in our laboratory, it was described that non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as aspirin and celecoxib inhibit the invasion of T. cruzi in cardiac cells of rats and promote the modulation of the inflammatory response. Exploring this mechanism, human DC- enriched peripheral blood mononuclear cells populations (DC-PBMC) were used as our model. Our results showed that treatment of DC-PBMC with celecoxib (CEL), a selective cyclooxygenase-2 inhibitor or SQ 22,536, adenylate cyclase inhibitor, inhibited T. cruzi infection. No effect was observed when the cells were treated with aspirin (ASA, a non-selective inhibitor of COX-1 and COX-2) as well as independent of nitric oxide (NO) production. Expression of co-stimulatory molecules CD80 and CD86 were similar in DC-PBMC treated with or not with both COX inhibitors. The infection did not stimulate TNF- secretion but increased the production of IL-1, IL- 6, IL-8, IL-10 and NO by the infected DC-PBMC. Treatment with ASA or CEL did not affect the production of TNF-, IL-6, IL-8, IL-10 and NO by infected DC-PBMC, but increased IL-1 production. Our results reinforce the idea that COX-2 plays a fundamental role in the invasion of T. cruzi in the innate inflammatory response and may represent a relevant target for the development of new treatments for Chagas' disease. Key words: Trypanosoma cruzi. Cytokines. Dendritic cells. Aspirin. Celecoxib. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Mapa epidemiológico da doença de Chagas .................................... 12 Figura 2 – Esquema do ciclo biológico do Trypanosoma cruzi .......................... 15 Figura 3 – Modelos de invasão do Trypanosoma cruzi. (A) Via dependente de lisossomo; (B) via dependente de actina; (C) via independente de lisossomo. ............................................................. 19 Figura 4 – Subtipos de células dendríticas murinas e humanas e seus marcadores fenotípicos ..................................................................... 29 Figura 5 – Metabolismo dos eicosanoides ......................................................... 38 Figura 6 – A cascata do ácido araquidônico – via da ciclooxigenase ................ 40 Figura 7 – Sítio ativo da ciclooxigenase. EE = espaço extra. BL = bolsa lateral. ............................................................................................... 42 Figura 8 – Esquema da ação da aspirina sobre a ciclooxigenase ..................... 45 Figura 9 – Estrutura química da aspirina (esquerda) e do celecoxibe (direita) .............................................................................................. 47 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA Ácido araquidônico AC Adenilato ciclase AINEs Antiinflamatórios não esteroidais ALX Receptor da lipoxina AMPc Adenosina-3’-5’ monofosfato ou AMP cíclico APC Célula apresentadora de antígeno ASA Aspirina ou ácido acetilsalicílico ATLs Lipoxinas desencadeadas pela aspirina CDs Células dendríticas CD11c Marcador de superfície celular das células dendríticas CD14 Marcador de superfície celular de monócitos e células dendríticas derivadas de monócitos CD80 Molécula co-estimuladora ou B7.1, presente em monócitos e células dendríticas CD86 Molécula co-estimuladora ou B7.2, presente em monócitos e células dendríticas CEL Celecoxibe COX Ciclooxigenase COX-1 Ciclooxigenase do tipo 1 COX-2 Ciclooxigenase do tipo 2 CREB Proteína ligada ao elemento de resposta do AMPc CVC Complexo vacúolo contrátil DAG Diacilglicerol DCs Células dendríticas DC-PBMCs Células mononucleares do sangue periférico humano enriquecidas com células dendríticas DTU Discrete Typing Unit. Conjunto de isolados que é geneticamente semelhante e que pode ser identificado por marcadores moleculares ou imunológicos comuns EPAC Proteína ativada por AMPc FSK Forscolina GP Glicoproteína GPCRs Receptores acoplados à proteína G HETE Ácido hidroxieicosatetraenóico HPETE Ácido hidroperoxieicosatetraenóico IFN Interferon IL-1 Interleucina do tipo 1 IP3 Inositol-1,4,5-trifosfato LO Lipoxigenase LTs Leucotrienos LXs Lipoxinas MdDCs Células dendríticas derivadas de monócitos MHC I Complexo de histocompatibilidade principal de classe 1 MHC II Complexo de histocompatibilidade principal de classe 2 MHC Complexo de histocompatibilidade principal NF-B Fator nuclear kapa B NK Células assassinas naturais NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintase NSAIDs Drogas anti-inflamatórias não esteroidais PAMPs Padrões moleculares associados a patógeno PDE Fosfodiesterase PG Prostaglandina PGE2 Prostaglandina da classe E2 PGHS Prostaglandina endoperóxido sintase ou ciclooxigenase PGI Prostaciclina PI3K Fosfatidilinositol-3-quinase classe I PIP3 Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato PKA Proteína quinase dependente de AMPc PKC Proteína quinase C PLA2 Fosfolipase A2 PLC Fosfolipase C PRRs Receptores de reconhecimento de padrões POP Prolil oligopeptidase SQ22,536 (9-(tetrahidro-2-furanil)-9H-purina-6-amina Syt VII Sinaptotagmina VII Tc Trypanosoma cruzi TcAC Adenilato ciclase tripanosomatida TcTOX Hemolisina tripanosomatida TM Tripomastigotas TMC Tripomastigotas de cultura TCR Receptor de célula T TGF- Fator de crescimento beta Th1 Linfócito T auxiliar produtor de citocinas do padrão 1 Th2 Linfócito T auxiliar produtor de citocinas do padrão 2 TLR Receptor do tipo toll TNF Fator de necrose tumoral alfa TS Trans-sialidase TXA2 Tromboxana A2 VP Vacúolo parasitóforo WT Linhagem selvagem SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 12 1.1 DOENÇA DE CHAGAS ............................................................................. 12 1.1.1 Epidemiologia ............................................................................................ 12 1.1.2 Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi ......................................................... 14 1.1.3 Aspectos clínicos da doença de Chagas ................................................... 16 1.2 A INVASÃO DA CÉLULA DO HOSPEDEIRO É UM EVENTO CRÍTICO NO ESTABELECIMENTO DA INFECÇÃO POR Trypanosoma cruzi .................................................................................... 18 1.2.1 Infecção em células que não fazem fagocitose ......................................... 18 1.2.2 Infecção de células fagocíticas ................................................................. 25 1.3 CÉLULAS DENDRÍTICAS E Trypanosoma cruzi ...................................... 26 1.3.1 Aspectos gerais das células dendríticas ................................................... 26 1.3.2 Células dendríticas murinas e Trypanosoma cruzi .................................... 30 1.3.3 Células dendríticas humanas e Trypanosoma cruzi .................................. 35 1.4 EICOSANOIDES....... ................................................................................ 38 1.4.1 Via da ciclooxigenase e receptores prostanoides ..................................... 39 1.4.1.1 Enzima ciclooxigenase .............................................................................. 41 1.4.2 PGE2 e DCs .............................................................................................. 42 1.5 ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDAIS .......................................... 44 1.5.1 Aspirina. .................................................................................................... 44 1.5.2 Celecoxibe... ............................................................................................. 46 1.6 EICOSANOIDES E Trypanosoma cruzi .................................................... 47 1.6.1 Aspirina e células dendríticas .................................................................... 50 1.7 ADENILATO CICLASE .............................................................................. 51 1.7.1 AMPc e células dendríticas ....................................................................... 53 1.7.2 AMPc e Trypanosoma cruzi ...................................................................... 54 2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 55 3 OBJETIVOS .............................................................................................. 56 3.1 OBJETIVO GERAL.. ................................................................................. 56 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... .................................................................. 56 ARTIGO CIENTÍFICO ............................................................................................... 57 CONCLUSÃO ........................................................................................................... 70 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 71 ANEXOS ................................................................................................................... 99 ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos .................................................................................................................100 ANEXO B – Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais – Projeto 2012 .....101 ANEXO C - Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais – Projeto 2014......102 ANEXO D - Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais – Manutenção do Trypanossoma cruzi 2015 ..................................................................................103 ANEXO E - Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais - Manutenção do Trypanossoma cruzi 2017 ..................................................................................104 12 1 INTRODUÇÃO 1.1. DOENÇA DE CHAGAS 1.1.1. Epidemiologia A doença de Chagas ou tripanososomíase americana é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e constitui uma zoonose típica das regiões tropical e subtropical da América Latina, estendendo-se até a região sudeste dos Estados Unidos da América (DIAS, 2006). Estima-se que entre seis e sete milhões de pessoas estejam cronicamente infectadas e 25 milhões em situação de risco em 21 países da América Latina (RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010; THE LANCET EDITORIAL, 2006; WHO, 2017). Atualmente, devido às migrações internacionais, a Doença de Chagas pode ser encontrada no Canadá, Estados Unidos, em vários países da Europa, no Japão e na Austrália (figura 1) (CONNERS et al., 2016; SCHMUNIS; YADON, 2010). Estima-se que mais de trezentos mil indivíduos infectados vivam nos Estados Unidos, sendo a maioria composta de imigrantes provenientes do México e da América Central (BERN; MONTGOMERY, 2009; CHIN; ARABOV; MANDEL, 2013; CONNERS et al., 2016). Figura 1. Mapa epidemiológico da doença de Chagas. Fonte: Adaptado de RASSI; RASSI; MARIN-NETO (2010). 13 A doença é transmitida pelas fezes eliminadas durante a picada de insetos vetores contaminados da família Reduviidae, especialmente das espécies Triatoma infestans, Rhodnius prolixus e Panstrongylus megistus, conhecidos popularmente como barbeiros, devido à preferência pela região do rosto onde costumam sugar sangue (GALVÃO, 2014). Pode ocorrer também a transmissão por transfusão de sangue ou transplacentária, produzindo os casos de infecção congênita (JORGE; CASTRO, 2000). Em 2006 o Brasil obteve a Certificação Internacional de Eliminação da Transmissão da Doença de Chagas por Triatoma infestans, conferida pela Organização Pan-Americana de Saúde e atualmente a transmissão oral tem sido destaque no país, principalmente na Amazônia Legal (FERREIRA; SILVA, 2006). Durante os anos 2000-2011 foram notificados mais de 1.200 casos agudos da Doença de Chagas em 138 surtos, sendo 776 (71%) atribuídos à ingestão de alimentos e bebidas contaminados com T. cruzi, entre eles açaí, bacaba, jaci (coquinho), caldo de cana e o palmito de babaçu (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015; SHIKANAI-YASUDA; CARVALHO, 2012). A doença de Chagas também é importante devido ao seu impacto econômico. A mortalidade precoce e a incapacidade causadas por esta doença, que muitas vezes ocorre na população mais produtiva (adultos jovens), resulta em uma perda econômica significativa. As complicações cardíacas e digestivas frequentemente levam à necessidade de tratamento e procedimentos cirúrgicos de longo prazo, incluindo marcapasso e implantação de desfibrilador cardíaco e transplante cardíaco, aumentando ainda mais os custos relacionados à doença (FRANCO-PAREDES, et al., 2007; LEE, et al., 2013). Nos países latino-americanos, a doença se enquadra no grupo das doenças tropicais negligenciadas, ou seja, doenças associadas à pobreza e negligenciadas pelos órgãos de comunicação, sociais e políticos com um impacto adverso importante na saúde, bem-estar e desenvolvimento socioeconômico em países de baixa renda e em desenvolvimento (MATHERS; EZZATI; LOPEZ, 2007). Vários estudos têm demonstrado as vantagens econômicas da prevenção da doença através de programas de controle de vetores (CASTILLO-RIQUELME et al., 2008; MONCAYO; SILVEIRA, 2009), uma estratégia que se mostrou eficaz em iniciativas colaborativas internacionais na América Latina (ABUHAB et al., 2013; MONCAYO; SILVEIRA, 2009) 14 Segundo dados da organização Drugs For Neglected Diseases iniciative (DNDi), a doença de Chagas, sozinha, é responsável, por cerca de 12 mil mortes por ano na região da América Latina. E representa um custo global de US$ 7,2 bilhões por ano. O Brasil está no topo do ranking em perdas de produtividade com um custo de US$ 129 milhões para a saúde pública por ano (AGÊNCIA FIOCRUZ DE NOTÍCIAS, 2013). À medida que a doença se expande para além da América Latina, há uma preocupação crescente com relação à sua carga econômica global. Um estudo recente estima os custos globais de US$ 7,19 bilhões/ano, superando muitas doenças proeminentes globalmente, como câncer cervical e rotavirose (LEE et al., 2013). Mais de 10% destes custos emanam dos Estados Unidos e Canadá, onde a doença não é endêmica e não é reconhecida como um problema de saúde significativo (MATHERS, EZZATI e LOPEZ, 2007; MONCAYO e SILVEIRA, 2009; SCHOFIELD; DIAS, 1991). 1.1.2 Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi T. cruzi exibe diferentes formas durante seu ciclo de vida encontradas em dois hospedeiros - um inseto vetor e um mamífero (DE LANA; MARQUES; MACHADO, 2010). As formas evolutivas do T. cruzi são reconhecidas por apresentarem forma esférica, piriforme ou alongada e pela posição relativa do núcleo e cinetoplasto e da posição do flagelo em relação à bolsa flagelar. São elas epimastigota, tripomastigota, amastigota e esferomastigota, sendo essa última encontrada no estômago do inseto vetor e em determinadas situações experimentais in vitro (DE LANA; MARQUES; MACHADO, 2010). O ciclo de vida do T. cruzi (figura 2) inicia-se quando o vetor triatomíneo ingere formas tripomastigotas circulantes no sangue de um hospedeiro mamífero. As formas tripomastigotas sanguíneas diferenciam-se em formas epimastigotas no intestino médio, a forma replicativa no hospedeiro invertebrado. As formas epimastigotas migram para a porção final do intestino e diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicos infectantes, os quais são excretados nas fezes do inseto vetor. Os tripomastigotas metacíclicos entram no hospedeiro mamífero através da solução de continuidade na pele criada pela picada do inseto ou através 15 de membranas mucosas intactas e invadem as células nucleadas (BERN, 2015; RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010). Figura 2. Esquema do ciclo biológico do Trypanosoma cruzi. Fonte: Adaptado de BERN (2015). No interior do citoplasma dessas células, os tripomastigotas diferenciam-se em formas amastigotas, as quais replicam-se a cada 12 horas no período de 4 a 5 dias. Ao final desse período, os amastigotas transformam-se novamente em tripomastigotas, rompem as células, invadem tecidos adjacentes e espalham-se através dos vasos linfáticos e sanguíneos e chegam a tecidos distantes, invadindo outras células, principalmente células musculares (cardíacas, lisas ou esqueléticas) e ganglionares, e iniciam um novo ciclo replicativo ou podem ser ingeridos pelo inseto vetor quando este se alimentar no hospedeiro mamífero (BERN, 2015; RASSI; RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012, RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010). 16 1.1.3 Aspectos clínicos da doença de Chagas A doença de Chagas ocorre em duas fases, aguda e crônica. A fase aguda inicia-se com a entrada do parasito no hospedeiro humano. O período de incubação dura de 1 a 2 semanas na transmissão vetorial ou de 20 a 40 dias na transmissão por transfusão sanguínea. Os sintomas normalmente são inespecíficos, como febre, mal-estar, hepatoesplenomegalia e linfocitose, o que dificulta o diagnóstico nessa fase. Raramente surgem manifestações no local da entrada do parasito, mas quando presentes podem surgir o chagoma de inoculação (nódulo na pele) ou o sinal de Romaña (edema bipalpebral unilateral), quando a entrada é na mucosa ocular. Outra característica dessa fase é o grande número de parasitas circulantes no sangue (alta parasitemia). Quando ocorre morte nessa fase, o que é raro, dá-se pela miocardite grave e falência cardíaca (RASSI; RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012). Os pacientes que sobrevivem à fase aguda desenvolvem uma resposta imune mediada por células que controla a replicação do parasito (CARDOSO; REIS- CUNHA; BARTHOLOMEU, 2016). A fase crônica da infecção inicia-se e muitos pacientes permanecem assintomáticos por toda a vida, a chamada forma indeterminada da doença. Estima-se que 20 a 30% das pessoas infectadas apresentarão progressão no curso de décadas para a cardiopatia chagásica crônica e 10% para a forma digestiva, neurológica ou alterações mistas (RASSI; RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012; WHO, 2017). No Brasil, a cardiopatia chagásica crônica é uma importante causa de morte entre adultos de 30 a 60 anos e uma grande causa de implante de marcapasso e transplante cardíacos (FIOCRUZ, 2013). A forma indeterminada da doença é definida pela presença de infecção confirmada por testes parasitológicos e sorológicos, eletrocardiograma normal, exames radiológicos do pulmão, esôfago e cólon normais e ausência de sintomas clínicos (RIBEIRO; ROCHA, 1998; MARIN-NETO et al., 2002). A maioria das pessoas em áreas endêmicas encontra-se nesse estágio da doença e aproximadamente 40% desses pacientes podem persistir por anos nessa situação clínica (DIAS, 1989; NUNES et al., 2013). A forma cardíaca ou cardiomiopatia chagásica caracteriza-se pela miocardite crônica que envolve toda a parede cardíaca e o sistema de condução (MARIN-NETO et al., 2007; RIBEIRO et al., 2012). As alterações no sistema de condução levam à bradiarritmias e taquiarritimias, aneurisma apical, insuficiência cardíaca, 17 tromboembolismo e morte súbita. A combinação de bloqueio do ramo direito e bloqueio fascicular anterior esquerdo é típica na cardiomiopatia chagásica (ANDRADE et al., 2011; MAGUIRE et al., 1987; NUNES et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013). Tais alterações são decorrentes da persistência do parasito no tecido cardíaco (BENVENUTI et al., 2008), baixa parasitemia e lesão miocárdica mediada pelo sistema imune (COSSIO et al., 1976; DUTRA et al., 1994; HIGUCHI et al., 1997), a qual contribui para o dano autonômico (AMORIM et al., 1968; KÖBERLE, 1968; OLIVEIRA, 1985; RIBEIRO et al., 2005) e distúrbios microvasculares (BENVENUTI et al., 2008; FERRANS et al, 1988; HIGUCHI et al., 1999). As abordagens terapêuticas para o manejo da cardiomiopatia chagásica seguem as mesmas recomendações padrão para o tratamento da insuficiência cardíaca não chagásica. Os inibidores da enzima conversora da angiotensina e os betabloqueadores são as principais drogas utilizadas (BOTONI et al., 2007). Embora os betabloqueadores tenham sido evitados em pacientes com doença de Chagas, devido a bradiarritmias, alguns estudos demonstraram que a terapia com betabloqueadores é segura e foi associada com melhor sobrevida (BOTONI et al., 2007; ISSA et al., 2010). Seus efeitos sobre o sistema adrenérgico parecem ser uma estratégia atraente para prevenir a morte cardíaca súbita (BESTETTI et al., 2008; BESTETTI et al., 2011). O transplante cardíaco é o tratamento de escolha para pacientes com insuficiência cardíaca avançada, incluindo aqueles dependentes de drogas inotrópicas e/ou suporte circulatório (ANDRADE et al., 2011; BESTETTI et al., 2008). Uma grande preocupação no receptor de transplante cardíaco é a consequência da terapia imunossupressora de longo prazo após o transplante que acarreta o risco de reativação da infecção por T. cruzi (FIORELLI et al., 2011). Como consequência da persistente escassez de órgãos de doadores, tem havido um interesse crescente por estratégias alternativas, em particular no suporte circulatório mecânico. Os dispositivos de assistência ventricular esquerda têm sido utilizados em alguns pacientes, geralmente como uma ponte para o transplante (BOCCHI; FIORELLI; 2001; FIORELLI et al., 2011; SCHMID et al., 2005). A forma digestiva predominantemente afeta o esôfago, o cólon ou ambos e resulta da lesão aos neurônios intramurais (DE OLIVEIRA et al., 1998; PINAZO et al., 2010). As manifestações da doença esofágica vão desde desordens de 18 motilidade assintomáticas e acalasia leve até megaesôfago grave, com sintomas que incluem disfagia, odinofagia, refluxo esofágico, perda de peso, aspiração, tosse e regurgitação. Os sintomas esofágicos podem ser tratados por drogas que promovem o relaxamento do esfíncter ou por miotomia laparoscópica. O megacólon é caracterizado por constipação prolongada que pode evoluir para fecaloma, vólvulo e isquemia intestinal. Os estágios iniciais da doença colônica respondem a dietas ricas em fibras, laxantes ou enemas. Os estágios mais avançados do megaesôfago e do megacólon requerem ressecção cirúrgica (DE OLIVEIRA et al., 1998). A forma cardiodigestiva é uma combinação de doença cardíaca com megaesôfago ou megacólon, ou ambos. Na maioria dos países, o desenvolvimento do megaesôfago geralmente antecede a doença cardíaca e do cólon, mas a prevalência exata da forma cardiodigestiva não é conhecida porque poucos estudos adequados foram feitos (RASSI; RASSI; MARCONDES DE REZENDE, 2012). 1.2 A INVASÃO DA CÉLULA DO HOSPEDEIRO É UM EVENTO CRÍTICO NO ESTABELECIMENTO DA INFECÇÃO POR Trypanosoma cruzi 1.2.1 Infecção em células que não fazem fagocitose Nos mamíferos, o ciclo evolutivo do T. cruzi inicia-se com a penetração de tripomastigotas metacíclicos eliminados nas fezes e urina do inseto vetor, através da pele lesada ou mucosa (GARCIA et al., 2007). A forma tripomastigota circula na corrente sanguínea e invade as células hospedeiras e, inicialmente, aloja-se no interior de um vacúolo endocítico, o vacúolo parasitóforo (DE CARVALHO; DE SOUZA, 1989). A exposição das formas tripomastigotas a este ambiente ácido é necessária à secreção e atividade da proteína TcTox, atuante na formação de poros na membrana vacuolar e, consequentemente, no escape para o citoplasma. O meio ácido parece, também, ter papel importante no início da diferenciação de tripomastigotas em amastigotas, forma intracelular proliferativa. Esse processo se inicia no vacúolo e termina no citoplasma. Foram propostos três mecanismos distintos de entrada do T. cruzi na célula hospedeira (figura 3). A via dependente de lisossomo (A) é iniciada pela exocitose de lisossomos Ca2+-mediada. Na via dependente de actina (B), as formas 19 tripomastigotas (TM) penetram na célula através da expansão da membrana plasmática actina-mediada que culmina na formação do vacúolo endocítico. Na via independente de lisossomo (C), os parasitos entram na célula através de invaginações da membrana plasmática que acumulam fosfatidilinositol-3,4,5- trifosfato (PIP3), produto da ativação da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K), sendo internalizados em um vacúolo endossômico primário que posteriormente se funde como lisossomos. As três vias culminam na formação do vacúolo parasitóforo (revisado por DE SOUZA, DE CARVALHO; BARRIAS, 2010; revisado por SIBLEY, 2011). Após escapar do vacúolo, T. cruzi se diferencia na forma amastigota e permanece livre no citoplasma da célula hospedeira em estado quiescente por algumas horas e inicia, posteriormente, seu processo de replicação por fissão binária (figura 3). Em seguida, as formas amastigotas diferenciam-se, novamente, em tripomastigotas (revisado por DE SOUZA, DE CARVALHO; BARRIAS, 2010; revisado por SIBLEY, 2011). Figura 3. Modelos de invasão do Trypanosoma cruzi. (A) Via dependente de lisossomo; (B) via dependente de actina; (C) via independente de lisossomo. Fonte: Adaptado de DE SOUZA, DE CARVALHO; BARRIAS (2010). 20 A intensa movimentação gerada pelos parasitos no interior da célula hospedeira promove sua ruptura e, consequentemente, a liberação dos tripomastigotas no meio extracelular tornando-os capazes de infectar novas células. A ruptura da célula parasitada determina reação inflamatória focal, caracterizada pela presença de neutrófilos, eosinófilos e células mononucleares, além de congestão e edema (ANDRADE, 2000; SOUZA, 2000). Assim sendo, constata-se que a invasão da célula do hospedeiro é um evento crítico no estabelecimento da infecção com T. cruzi (revisado por YOSHIDA, 2006; CAMPOS; MARTINS- TEIXEIRA; CARVALHO, 2016). As formas TM são capazes de parasitar diferentes tipos celulares como fibras musculares cardíacas, esqueléticas e lisas, fibroblastos e células gliais (ANDRADE, 2000). Foi demonstrado que T. cruzi pode infectar células L929 sem núcleo, ou seja, a infecção ocorre na ausência de transcrição gênica cromossomal e/ou nucleolar e do processamento do RNA (COIMBRA et al., 2007). Os diferentes mecanismos de invasão estão relacionados com o processo de adesão que envolve receptores e ligantes disponíveis tanto no parasito quanto na superfície de células-alvo específicas (CAMPOS; MARTINS-TEIXEIRA; CARVALHO, 2016; MAEDA; CORTEZ; YOSHIDA, 2012). A adesão do parasito à superfície celular varia de acordo com a população do parasito, com a forma evolutiva e com a célula-alvo (ARAÚJO-JORGE; BARBOSA; MEIRELLES, 1992). Diferentes tipos de carboidratos, presentes nas glicoproteínas e nos glicolipídeos da superfície do parasito e da célula hospedeira, parecem participar desse processo de adesão (CALVET et al., 2004; MEIRELLES et al., 1999). Glicoproteínas de superfície do T. cruzi são importantes para mobilização do cálcio intracelular, tanto do parasito quanto da célula hospedeira, sendo este fenômeno de grande importância para o processo de interiorização do parasito (CAMPOS, MARTINS-TEIXEIRA e CARVALHO, 2016). A maioria dos estudos realizados na tentativa de elucidar os mecanismos utilizados pelo protozoário T. cruzi utilizaram formas TM geradas em meio líquido ou a partir do cultivo celular (TMC) como sósias das formas encontradas no inseto vetor e no sangue, respectivamente. As análises dos dados da literatura permitem concluir que durante a entrada na célula do hospedeiro as formas TM e TMC utilizam 21 diferentes tipos de moléculas que induzem a transdução de sinal e mobilização de Ca2+. De acordo com Schenkman, Dias e Nussenzweig (1991) a adesão dos TM à superfície celular, mediada por receptores, está restrita a certas regiões da membrana. Ruiz e colaboradores (1998) descrevem que a capacidade dos tripomastigotas, de diferentes isolados de T. cruzi, de invadir as células hospedeiras é determinada pela expressão diferencial de glicoproteínas de superfície que exibem atividade sinalizadora de cálcio distinta. Três moléculas de superfície com atividade indutora de Ca2+ já foram identificadas, são elas: a gp82, gp30 e gp35/50. O papel dessas moléculas durante o processo de invasão celular foi deduzido por meio de experimentos nos quais a internalização de TM foi inibida por meio da utilização de glicoproteínas recombinantes ou com o uso de anticorpos monoclonais (CAMPOS; MARTINS-TEIXEIRA; CARVALHO, 2016; CORTEZ et al., 2003; RAMIREZ et al., 1993; RUIZ et al., 1993). Em adição, a análise de moléculas de superfície dos parasitos possibilitou sua divisão em dois grupos distintos quanto à capacidade de invasão, in vitro, de células de mamíferos (YOSHIDA, 2006). As populações que apresentam maior capacidade infectante não possuem as glicoproteínas de superfície gp90 e gp35/50. Tripomastigotas dos isolados mais infectivos, como o clone CL Brener, ligam-se à superfície da célula hospedeira através de gp82 e induzem a ativação de PTK (proteína tirosina quinase.). Essa sinalização também envolve a ativação da fosfolipase (PLC), a geração de IP3 (fosfatidilinositol 1,4,5 trifosfato) e, consequentemente, a mobilização de Ca2+ dos seus estoques intracelulares, provavelmente retículo endoplasmático (CORTEZ et al., 2014; YOSHIDA et al., 2000). Por outro lado, em isolados de menor capacidade infectante, como a cepa G, a ligação à superfície celular ocorre principalmente através de gp35/50, que promove uma cascata de sinalização menos eficiente. Nesses isolados, a cascata de sinalização é independente de PTK e PLC e provavelmente dependente de AMPc (AMP cíclico). O Ca2+ necessário para invasão parece ser liberado para o citosol a partir de vacúolos contendo um sistema de troca iônica Ca2+/H+, também chamados acidocalsiosomas (MAEDA; CORTEZ; YOSHIDA, 2012; revisto em YOSHIDA, 2006). O envolvimento das moléculas gp82, gp30 e gp35/50 na internalização de TM tem sido caracterizado em células de mamíferos que são fagócitos não 22 profissionais. Experimentos com diferentes isolados de T. cruzi mostraram que a taxa de infecção de macrófagos por TM correlaciona com aquela encontrada em células HeLa (SCHENKAMN; MORTARA, 1992). Segundo Andrews (1995) a elevação dos níveis intracelulares de cálcio na célula hospedeira, promove o recrutamento de lisossomos para o sítio de entrada do parasito seguido por sua fusão com a membrana e formação do vacúolo parasitóforo. Os lisossomos são deslocados por uma proteína motora associada aos microtúbulos, a cinesina (RODRÍGUEZ et al., 1996; TARDIEUX et al., 1992). Além disso, o processo de invasão é facilitado pela ruptura de microfilamentos de actina (TARDIEUX et al., 1992). A elevação dos níveis intracelulares de Ca2+ promove a fusão dos lisossomos com o plasmalema. A proteína sinaptotagmina VII, membro da família sinaptotagmina, está presente na superfície dos lisossomos de diferentes tipos celulares e possui um domínio de ligação ao Ca2+, regulando esse processo (CALER et al. 2001; YOSHIDA, 2006). Outras moléculas de superfície do parasito também participam do processo de invasão celular. Oligopeptidase B (Opb), uma serina endopeptidase expressa pelas formas tripomastigotas de T. cruzi, é capaz de ativar uma cascata de sinalização de Ca2+ dependente de PLC e IP3 (BURLEIGH; ANDREWS, 1995; RODRÍGUEZ et al., 1995). A cruzipaína, uma cisteína proteinase expressa em todas as formas do ciclo de vida do T. cruzi (PAIVA et al.,1998) também ativa cascatas de sinalização mobilizadoras de Ca2+, aumentando assim a eficácia do processo de invasão celular. Já a trans-sialidase (TS) transfere ácidos siálicos (2,3)-ligados de glicoproteínas e glicolipídios da superfície da célula-alvo para a superfície do parasito (SCHENKMAN, et al., 1991). O processo de sinalização é importante para início do processo de adesão e para formação de vacúolos parasitóforos (VP) eficientes. A presença do ácido siálico parece ser fundamental para correta justaposição das membranas do vacúolo nascente e dos tripomastigotas, promovendo a vedação do vacúolo e assim impedindo que T. cruzi escape durante o processo de internalização (HALL et al. 1992; LEY et al. 1990; LOPEZ et al. 2002). Em 2006, Rubin-de-Celis e colaboradores mostraram que o aumento na expressão de TS em TMC é responsável pela saída precoce dessas formas infectantes do VP para o citoplasma e subsequente diferenciação para formas amastigotas. 23 Atualmente, entendemos que a atividade de TS medeia vários efeitos biológicos que conduzem à subversão do sistema imunitário do hospedeiro, favorecendo assim tanto a sobrevivência do parasita como o estabelecimento de uma infecção crônica (NARDY et al., 2016). Adicionalmente, as proteínas GP160/CRP e T-DAF de superfície ancoradas com GPI, membros da família TS-inativa, conferiram proteção contra a morte por mediação do complemento evitando a montagem da C3 convertase (NORRIS, 1998; TOMLINSON et al., 1994). Além disso, os sialilglicoconjugados presentes na superfície do parasito devido à atividade de TS, podem ligar-se a lectinas do tipo Ig de ligação a SAcs (Siglec-E) em células dendríticas, suprimindo a produção de IL-12, uma citocina pró- inflamatória, prejudicando uma via de comunicação entre a resposta inata e adaptativa (ERDMANN et al., 2009). O tratamento de formas amastigotas com forscolina, um ativador da adenilato ciclase, aumentou a infectividade tanto do isolado G como do isolado CL em células HeLa, e o tratamento dessas formas com genisteína reduziu a infecção cerca de 45% a invasão do isolado G mas não do isolado CL em células HeLa, indicando a participação diferencial da proteína tirosina quinase durante a invasão dos diferentes isolados do T. cruzi (FERNANDES et al., 2006). Fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) e serina/treonina quinase (Akt) também são importantes reguladores do processo de invasão do T. cruzi em células não fagocíticas profissionais (WILKOWSKY et al., 2001). As PI3K regulam o processo de tráfico de membranas, fusão de endossomas e rearranjo do citoesqueleto (DOWNWARD, 2004). Esse processo de sinalização provavelmente modula a invasão mediada por lisossomas ou um outro associado à actina (PROCÓPIO; BARROS; MORTARA,1999). Além de participar no processo de invasão, a via sinalização PI3K/Akt também estimula mecanismos pró-sobrevivência nas células parasitadas (CHUENKOVA et al., 2001). Outra via de sinalização importante para invasão do T. cruzi é a que envolve o fator de crescimento beta (TGF-). TGF- é uma citocina que participa de inúmeros eventos celulares como a produção de matriz extracelular, regulação da miogênese, resposta imune, angiogênese e embriogênese. Experimentos com células epiteliais de pulmão deficientes nos receptores para TGF- demonstraram que o T. cruzi é incapaz de infectar essas células (MING; EWEN; PEREIRA, 1995). 24 Recentemente foi mostrado que o bloqueio farmacológico de TGF- com o composto SB-431542 pode ser uma nova ferramenta no controle da infecção de cardiomiócitos com T. cruzi (WAGHABI, et al., 2007). Moléculas de superfície do parasito são reconhecidas por um tipo específico de receptor, os receptores do tipo Toll (TLRs) presentes nas células do hospedeiro (KAYAMA; TAKEDA, 2010; RODRIGUES; OLIVEIRA; BELLIO, 2012). Os TLRs são receptores transmembrana do tipo 1 com domínio extracelular com repetições de leucina e uma cauda intracelular carboxi-terminal que contém uma região conservada denominada domínio de homologia Toll/receptor interleucina 1 (TIR). O domínio extracelular é responsável pelo reconhecimento do ligante e pelo processo de dimerização dos receptores, fundamental para sua ativação (WYLLIE et al., 2000). Até o momento 11 TLRs humanos e 13 TLRs murinos foram descobertos nas células de mamíferos (AKIRA, UEMATSU; TAKEUCHI, 2006). Esses receptores atuam na resposta imune inata e são parte de um grupo específico de receptores denominados receptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Os PRRs reconhecem padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs). Um PAMP é uma molécula altamente conservada que é expressa por uma classe de microrganismos e não é expressa pelas células hospedeiras (CAMPOS; GAZZINELLI, 2004; GAZZINELLI; DENKERS, 2006). Uma outra estratégia de invasão celular do T. cruzi foi apresentada por Fernandes e colaboradores (2007). Esses autores mostram que microdomínios ricos em colesterol e GM1 presentes nas membranas celulares de células alvo específicas participam do processo de invasão de formas infectantes do T. cruzi. Estudos in vitro da interação do parasito com células do hospedeiro nem sempre envolvem células que são alvos da infecção in vivo. Células tumorais e linhagens celulares de diferentes origens, comumente utilizadas nesses estudos, não representam verdadeiramente a situação de interação do parasito com células do hospedeiro mamífero (BARBOSA, 1999). Um dos pontos que ainda permanece em discussão, é o mecanismo de invasão por T. cruzi que ocorre em células fagocíticas e fagocíticas não profissionais. Uma série de estudos tem mostrado que citocalasinas B (CB) e citocalasinas D (CD) bloqueiam a entrada de formas epimastigotas e tripomastigotas em macrófagos, células Vero, e fibroblastos (ALEXANDER 1975; EBERT; BARBOSA 1981; HENRÍQUEZ; PIRAS; PIRAS, 1981; MEIRELLES et al., 1982; NOGUEIRA; 25 COHN, 1976; ZENIAN; KIERSZENBAUM, 1983), enquanto outros mostraram que ocorre invasão de formas tripomastigotas em fibroblastos tratados com CB, células MDCK e células HeLa (SCHENKMAN; DIAS; NUSSENZWEIG, 1991; SCHENKMAN e MORTARA, 1992). 1.2.2 Infecção de células fagocíticas Os macrófagos são também alvos da infecção parasitária, especialmente no início da infecção, quando TM são depositadas no tecido do hospedeiro por insetos. Além disso, os amastigotas liberados das células infectadas, também infectam macrófagos. Ambas as formas do parasito são absorvidas por fagocitose, inicialmente alojados em vacúolos parasitóforos, podem ser mortos por geração de óxido nítrico e peroxinitrito (ALVAREZ et al., 2011; RUBBO; DENICOLA; RADI, 1994; THOMSON et al., 1999). A maturação dos vacúolos parasitóforos em fagolisossomas é importante para a sobrevivência do parasito, que é necessária para sua ida para o citoplasma, evitando assim a ação dos radicais livres tripanocidas. No citoplasma diferenciam-se e replicam como ocorrem em células não fagocíticas. A entrada inicial dos parasitos em macrófagos ocorre provavelmente por meio de um processo fagocítico dependente de actina e um processo de invasão ativa semelhante ao descrito acima para células não fagocíticas (revisado por WALKER et al., 2014). Estudos ainda recentes indicam que a integridade dos microdomínios de membrana plasmática (“rafts”), compostos de colesterol, gangliósido GM, flotilina e caveolinas são importantes para o sucesso da infecção de macrófagos por formas tripomastigotas e amastigotas (BARRIAS et al., 2007; FERNANDES et al., 2007; HISSA et al., 2012). Não está claro se, no caso dos macrófagos, isso afeta apenas o processo de invasão ativa e/ou a via fagocítica. No entanto, a ruptura dos “rafts” parece diminuir a invasão de células não fagocíticas por tripomastigotas, provavelmente por desagregação de proteínas importantes das vias de sinalização que iniciam o processo de invasão (revisado por WALKER et al., 2014). 26 1.3 CÉLULAS DENDRÍTICAS E Trypanosoma cruzi 1.3.1 Aspectos gerais das células dendríticas Células dendríticas (DCs) são células derivadas da medula óssea que pertencem ao grupo de células apresentadoras de antígenos (APCs), sendo consideradas o membro mais importante devido à sua alta capacidade de reconhecer e internalizar antígenos no local da infecção (COLLIN; MCGOVERN; HANIFFA, 2013; HANIFFA et al., 2009). Elas ligam as respostas imunes inatas e adaptativas através da captura, processamento e expressão de antígenos na membrana de sua superfície celular (PLANELLES et al., 2003, STEINMAN, 2007). As DCs imaturas possuem uma ampla gama de receptores inatos que permitem o reconhecimento de patógenos através de PRRs, que ativam as DCs através de vias de sinalização que induzem sua maturação (PEARCE; EVERTS, 2015). Os receptores TLRs, abundantes na APC e localizados na superfície celular ou no lúmen dos endossomos, são um dos PRRs mais caracterizados e detectam eficientemente PAMPs (TAKEUCHI; AKIRA, 2010). O reconhecimento eficiente de patógenos leva ao desenvolvimento de uma resposta imune inata adequada; por exemplo, TLR2, localizado na membrana plasmática da DC, detecta vários componentes de agentes patogênicos e a sua estimulação induz a produção de várias citocinas pró-inflamatórias. O TLR9, localizado no endolisossomo da DC, está envolvido no reconhecimento de vírus, bactérias, protozoários e sua ativação também leva à produção de citocinas pró- inflamatórias (TAKEUCHI; AKIRA, 2010). Após o reconhecimento do antígeno, as DCs podem deslocar-se ao longo do corpo a partir de tecidos periféricos para órgãos/tecidos linfóides onde apresentam os antígenos processados através dos seus complexos de histocompatibilidade principais (MHC) para as células T (LIPSCOMB; MASTEN, 2002). O processo de maturação compreende a diferenciação das células especializadas na captura de antígenos em células especializadas na apresentação de antígenos e estimulação de células T. As DCs maduras podem ser identificadas por aspectos morfológicos como extensões citoplasmáticas e abundantes estruturas intracelulares (lisossomas, endossomas, grânulos, etc) relacionadas ao processamento de antígenos e pela modulação de marcadores moleculares como a 27 super expressão de CD83 e de moléculas co-estimuladoras como CD80 (ou B7-1) e CD86 (ou B7-2) e de MHC (O'NEILL; ADAMS; BHARDWAJ, 2004). As células dendríticas apresentam antígenos aos linfócitos T CD8+ e T CD4+ via MHC de classe I e MHC de classe II, respectivamente (BLUM; WEARSCH; CRESSWELL, 2013). Antígenos originários de fontes endógenas pelas moléculas do MHC de classe I; antígenos a partir de fontes exógenas pelo MHC de classe II. Algumas DCs têm uma capacidade típica, chamada apresentação cruzada, que permite carregar peptídeos de antígenos exógenos em moléculas do MHC de classe I (SEGURA; AMIGORENA, 2015; VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008). As moléculas MHC de classe I são expressas por todas as células nucleadas e a sua via de apresentação do antígeno consiste numa série de reações: (1) as proteínas intracelulares são degradadas pelo proteassoma; (2) os peptídeos são entregues ao retículo endoplasmático pelo transportador associado ao complexo de processamento de antígeno; (3) os antígenos são carregados em moléculas do MHC de classe I; (4) os complexos de peptídeo-MHC de classe I são transportados do Golgi até a superfície das células para a apresentação às células T CD8+ (NEEFJES et al., 2011; VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008;). Recentemente demonstrou-se que a infecção de células HeLa por T. cruzi cepa Y promove uma regulação negativa da biossíntese das subunidades de proteassoma bem como da expressão da molécula do MHC de classe I, o que poderia ser considerado um mecanismo de persistência do parasito dentro da célula (CAMARGO et al., 2014). Ao contrário da expressão do MHC de classe I, o MHC de classe II é principalmente expresso por APCs tais como DCs, macrófagos e células B (NEEFJES et al., 2011; VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008). Os antígenos extracelulares são recolhidos por APCs e colocados no fagossoma. Este compartimento funde-se com os lisossomas para formar fagolisossomas, onde as moléculas do MHC de classe II interagem com os antígenos. As moléculas de MHC de classe II carregadas com peptídeo são então transportadas para a superfície celular onde ligam-se a células T CD4+ antígeno específicas (NEEFJES et al., 2011; VYAS; VAN DER VEEN; PLOEGH, 2008). Curiosamente, as moléculas de MHC de classe II estão em constante processo de reciclagem e degradação em DCs imaturas, mas as DCs maduras exibem uma apresentação de antígeno estável e prolongada (DEN HAAN; ARENS; ZELM, 2014). 28 Vale ressaltar que a apresentação de antígenos pela DC não é suficiente para ativação e proliferação dos linfócitos T. A expressão de moléculas co- estimulatórias e a produção de citocinas também são necessárias e são proporcionadas eficientemente por DCs maduras (DEN HAAN; ARENS; ZELM, 2014). Após a ativação através de TLRs, as DCs podem produzir citocinas relacionadas à imunidade inata envolvidas em respostas locais e sistêmicas tais como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-; no entanto, em condições específicas, as DCs também são capazes de produzirem IL-10 e TGF- para dirigir uma resposta regulatória (HOLDSWORTH; CAN, 2015; VERHASSELT et al., 1997). Diferentes subtipos de DCs e níveis de maturação podem produzir diferentes tipos de citocinas ou moléculas co-estimulatórias que levam a uma resposta inflamatória ou regulatória. Entre os subtipos de DC, a mielóide (mDC ou DC clássica), a plasmocitóide (pDC), as células de Langerhans (LCs) e as derivadas de monócitos (MdDCs) são alguns exemplos bem conhecidos. Em murinos, as mDCs são compostas por dois grupos principais: residentes e migratórias, que são divididas em dois subtipos: DCs dependentes de Batf3 e dependentes de IRF4 (Revisado por DURAND; SEGURA, 2015). mDC Batf3- dependente/migratória expressa CD11c, Clec9A, XCR1, CD103 e CD207; enquanto que a residente expressa CD11c, Clec9A, XCR1 e CD8. Por outro lado, mDC IRF4- dependente/residente expressa CD11c, CD11b, CD172a; os mesmos marcadores são encontrados nos subtipos migratórios junto com CD206 (Revisado por SEGURA, 2016), figura 2. Os principais marcadores para pDC são CD11c, Ly6c, B220 e Siglec H. Para MdDCs, eles são CD11c, CD11b, CD64, FcRI, CD206, CD14, CD172a e Ly6c (Revisado por SEGURA, 2016), figura 2. Finalmente, LCs são uma população especial de DC presente na epiderme e em outros epitélios escamosos estratificados, como membranas mucosas orais e genitais e brônquios. Apesar de estarem associadas a estes tecidos, as LCs podem diferenciar-se em células migratórias para a apresentação de antígenos. Os seus marcadores principais são CD11c, CD207, EpCAM e E-caderina (Revisado por GORDON et al., 2014), figura 2. 29 Os marcadores clássicos das MdDCs humanas são CD11c, Dectin 1 (CLEC7A) e Dectin 2 (CLEC6A). Em relação às pDCs, CD303 (CLEC4C), CD304 (neuropilina) e CD123 (IL-3R) são marcadores humanos comuns. As MdDCs podem expressar CD14, CD209 (DC-SIGN), CD16 e CD1c (Revisado por COLLIN; MCGOVERN; HANIFFA, 2013), figura 2. Lewis e Reizis (2012) propuseram a existência de mais dois tipos de DCs dentro desses subtipos: células “receptoras” mais especializadas na captura de antígenos e produção de citocinas e células “apresentadoras”, células que se beneficiam dessas citocinas e migram para os linfonodos para apresentar os antígenos, representando outro nível de especialização entre as DCs, indicando sua diversidade e sua capacidade de orientar a polaridade, a magnitude e a especificidade das respostas imunes. Figura 4. Subtipos de células dendríticas murinas e humanas e seus marcadores fenotípicos. Fonte: Adaptado de SEGURA; AMIGORENA (2015). Alguns estudos demonstraram que as fases aguda e crônica da doença de Chagas requerem diferentes polarizações da resposta imune: a resposta Th1 é protetora na fase aguda e a resposta regulatória é importante na prevenção da fase crônica (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014, DUTRA et al., 2015). Por esta razão, as DCs são um grupo-chave de células na doença de Chagas: elas podem modular a resposta dependendo do tipo, nível de maturação, 30 tipos de citocinas e receptor da DC envolvidos, tendo um papel fundamental no desenvolvimento das formas da doença, incluindo o estágio indeterminado. 1.3.2 Células dendríticas murinas e Trypanosoma cruzi Estudos sobre a doença de Chagas aguda em seres humanos são limitados devido à falta de sintomas únicos que caracterizam este estado da doença. No entanto, ampliar o conhecimento sobre a fase aguda é importante porque os eventos imunológicos que ocorrem nesta etapa têm grande influência no possível desenvolvimento da fase crônica. Neste contexto, a infecção murina experimental pode imitar a doença humana, dando-nos uma visão semelhante ao que acontece no início da infecção por T. cruzi (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014). Diferente da resposta habitual das DCs durante uma infecção, a expressão de importantes moléculas de superfície como MHC, CD80 ou CD86 pode ser reduzida quando as DCs reconhecem os antígenos de T. cruzi de forma dependente da cepa, limitando a maturação da DC e a sua capacidade de apresentação de antígeno (GIL-JARAMILLO et al., 2016). Durante a fase aguda, as DCs esplênicas infectadas pela cepa Tehuantepec do T. cruzi apresentam baixa expressão de moléculas CD86 e são incapazes de migrarem para órgãos/tecidos linfóides (CHAUSSABEL et al., 2003). A cepa RA altamente virulenta do T. cruzi (TcVI) em DCs de medula óssea, induz uma regulação para baixo da produção de citocinas e da capacidade endocítica adicionada a uma supressão do MHC de classe II, em comparação com as células não infectadas (PONCINI et al., 2008). Estes dados estão em concordância com o estudo de Alba Soto e colaboradores (2003), que também detectaram uma expressão diminuída de MHC de classe II em DC esplênicas infectadas pela mesma cepa de T. cruzi. Além disso, mostraram que o comportamento da DC induzido pela cepa RA não ocorre para a cepa não virulenta K98 do T. cruzi (TcI). Outro estudo comparativo de infecção, usando MdDCs, foi realizado usando cepas de 2 DTUs diferentes, TcI (AQ1.7 e MUTUM) e TcII (1849 e 2369) (DA COSTA et al., 2014). DTU (discrete typing unit) é definido como um conjunto de isolados que é geneticamente semelhante e que pode ser identificado por 31 marcadores moleculares ou imunológicos comuns (TIBAYRENC, 1998). T. cruzi foi dividido em 6 DTUs (ZINGALES et al., 2009). Os resultados obtidos por Da Costa e colaboradores (2014) demonstraram que as DTUs de T. cruzi estudadas podem modular DCs em diferentes extensões e esta modulação variou mais entre as cepas do que entre as DTUs. Em geral, ambas as DTUs induziram a produção e a expressão de moléculas anti-inflamatórias, tais como IL-10, produção de PD-L1 e expressão de TLR2. Em relação à expressão de TLR2, parece que T. cruzi tem moléculas que se ligam a este receptor promovendo a produção de citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 (DA COSTA et al., 2014). Em contrapartida, as moléculas pró-inflamatórias não apresentaram um padrão, variando dependendo da cepa. Finalmente, eles também demonstraram que a expressão da DC de moléculas de diferenciação e ativação não foi polarizada, o que sugere que cada cepa de T. cruzi possivelmente desenvolveu estratégias específicas de evasão (DA COSTA et al., 2014). Quando duas linhagens de camundongos foram infectadas pela cepa Y do T. cruzi altamente virulenta (TcII), a suscetível mostrou DCs esplênicas com capacidade reduzida de apresentação de antígenos e menor expressão de moléculas CD40 e CD86 em comparação com a linhagem resistente (PLANELLES et al. 2003). É bem conhecido que a deficiência de sinais co-estimuladores durante a apresentação cruzada pode reduzir a estimulação das células T ou conduzir a um estado anérgico. Assim, parece que a função prejudicada da DC pode ajudar o parasita a evadir do sistema imunológico do hospedeiro (BOUSSIOTIS et al., 1996). A produção de citocinas é outro aspecto importante durante as interações DCs - T. cruzi, particularmente a produção de IL-12, considerada uma molécula protetora durante a infecção aguda, uma vez que ativa uma resposta adaptativa Th1 polarizada que permite ao hospedeiro controlar adequadamente o crescimento do parasito através de IFN- (ANDRADE; GOLLOB; DUTRA, 2014). Em concordância, DCs de linhagens de camundongos resistentes a T. cruzi super expressaram IL-12 e TNF- enquanto que as linhagens susceptíveis produziram a citocina IL-4 de perfil Th2 (PLANELLES et al., 2003). Sabe-se que a IL-4 medeia a susceptibilidade do hospedeiro ao T. cruzi, mas também é necessária para prevenir a hiperatividade imunológica e a imunopatologia (ABRAHAMSOHN; COFFMAN, 1996; LAUCELLA; ROTTENBERG; TITTO, 1996). 32 Terrazas e colaboradores (2011) demonstraram o papel protetor da IL-12 através da infecção por T. cruzi cepa Queretaro (TcI) de camundongos deficientes em MIF (fator inibidor da migração de macrófagos). O MIF é uma citocina pleiotrópica produzida por vários tipos de células diferentes, incluindo DCs, que modula a expressão de várias moléculas pró-inflamatórias (COOKE; ARMSTRONG; DONNELY, 2009). Parece que ele favorece a maturação da DC através da secreção de IL-12 e da ativação da proteína p38 MAPK, uma quinase envolvida na maturação da DC. Por outro lado, camundongos deficientes em MIF apresentaram níveis mais baixos da produção de IL-12 e DCs de medula óssea imaturas, levando a uma susceptibilidade à infecção por T. cruzi Queretaro (TcI). A citocina reguladora IL-10 também está associada à suscetibilidade do hospedeiro durante o estágio agudo da doença de Chagas, limitando a indução de mecanismos efetores antimicrobianos por parte das DCs, como a supressão da migração da DC para os linfonodos de drenagem (ALBA SOTO et al., 2010; CORINTI et al., 2001; DEMANGEL; BERTOLINO; BRITTON, 2002). Uma única injeção intravenosa de DCs deficientes em IL-10 que foram pulsadas com antígenos parasitários conferiu um controle eficaz contra um desafio letal com a cepa de T. cruzi RA em camundongos. As DCs deficientes em IL-10 eram produtoras de níveis elevados de citocinas Th1 e indutoras de linfócitos T antígeno-específicos após a imunização (ALBA SOTO et al., 2010). Por outro lado, Poncini e colaboradores (2010) demonstraram que a interação de DCs com tripomastigotas de T. cruzi foi incapaz de ativar as DCs, e estas células se tornaram produtoras de TGF- e IL-10 e não foram eficientes como estimuladoras de linfócitos, sendo classificadas como DCs regulatórias. As DCs maduras têm a capacidade de induzir a ativação e proliferação das células NK. As células NK desempenham um papel significativo na resposta imune inata e na vigilância como resultado da sua produção de citocinas e citólise das células infectadas. Além disso, as células NK secretam IFN-, TNF- e GM-CSF, que promovem a maturação da DC e a ativação de células T (GEROSA et al., 2002; PICCIOLI et al., 2002). Também foi demonstrado o importante papel dos TLRs no reconhecimento do T. cruzi pela primeira linha de células de defesa, incluindo DCs. A infecção com T. cruzi induz o recrutamento de TLR9 para o compartimento endolisossomal, promovendo sua interação durante a fagocitose inicial. Os motivos estimuladores 33 contendo CpG de T. cruzi CL Brener, particularmente aqueles formados por genes que codificam proteínas semelhantes à mucina, também levaram o TLR9 aos lisossomas de DC de medula óssea e à indução de IL-12 bem como à síntese de IFN- (BARTHOLOMEU et al., 2008). Tal atividade proinflamatória potente e, consequentemente, o controle da replicação do parasita, poderia levar à resistência do hospedeiro à infecção ou evitar a letalidade do hospedeiro e à manutenção da persistência do parasita de ciclo de vida longo. A segunda hipótese sugere outra adaptação do T. cruzi à imunidade mediada por células hospedeiras (BARTHOLOMEU et al., 2008). Gravina e colaboradores (2013) afirmaram que a população de DC constitui a principal fonte de produção de IL-12/IL-23p40 em uma via dependente de TLR9 na infecção por T. cruzi cepa Y. Além disso, quando as DCs eram incapazes de produzir IL-12/IL- 23p40, os macrófagos recuperaram a sua capacidade de responder ao agonista de TLR9, o que pode representar uma resposta compensatória. Por conseguinte, a modulação de TLR9 é importante para controlar a resposta inflamatória nas diferentes células, mas TLR9 atua fundamentalmente na atividade inflamatória da DC na infecção por T. cruzi (GRAVINA et al., 2013). A sinergia entre TLRs em DCs infectadas por parasitas também foi estudada. Quando os camundongos deficientes em MyD88/TRIF (Toll/IL-1R contendo o adaptador que induz o IFN-) (isto é, sem ativação funcional dos TLRs) foram infectados com a cepa Tulahuen de T. cruzi (TcVI), a depuração do parasito foi prejudicada principalmente pela ausência da produção de IFN- (KOGA et al., 2006). No mesmo trabalho, foi proposto que a produção de citocinas pró- inflamatórias é uma indução dependente de MyD88 e a expressão de IFN- é dependente de TRIF. Em qualquer caso, ambos os adaptadores de TLR contribuem para respostas imunes inatas contra a infecção por T. cruzi (KOGA et al., 2006). A proteína UNC93B1, que interage com TLR3, TLR7 e TLR9, parece desempenhar um papel essencial na proteção do hospedeiro contra a infecção por T. cruzi (CAETANO et al., 2011). Os camundongos deficientes em UNC93B1 foram mais susceptíveis à infecção por T. cruzi e produziram uma concentração mais baixa de IL-12p40 e IFN-. Essa susceptibilidade também foi alcançada durante a infecção pelo T. cruzi com camundongos deficientes em TLR3/TLR7/TLR9, demonstrando 34 que os TLRs sensores de ácidos nucleicos são determinantes críticos da resistência do hospedeiro à infecção primária com T. cruzi (CAETANO et al., 2011). Outros receptores também têm sido propostos para desempenhar um papel importante durante a fase aguda da doença de Chagas. Os camundongos deficientes em receptores B2 (B2R) de bradicinina (BK) foram mais susceptíveis à infecção por T. cruzi cepa Dm28c (TcI) do que os animais WT (MONTEIRO et al., 2007). Os B2Rs reconhecem cininas liberadas por T. cruzi, mediadores relacionados à bradicinina que ativam DCs imaturas (MONTEIRO et al., 2006). As DCs esplênicas sem receptor B2R não produzem IL-12, apontando um papel crítico para a via de sinalização das cininas no desenvolvimento de células T efetoras do tipo 1 (MONTEIRO et al., 2007). Num estudo recente, o mesmo grupo demonstrou que o bloqueio de B2R juntamente com o receptor C5a resultou em DCs esplênicas incapazes de produzir IL-12p40/70 e IFN- (SCHMITZ et al., 2014). C5a é uma anafilatoxina derivada da proteólise do complexo C5 do sistema complemento, cuja função biológica é ativar células da linhagem mielóide (KLOS et al., 2009). No entanto, eles mostraram que as moléculas de C5a parecem ser produzidas através da atividade da cruzipaína do T. cruzi durante a infecção e podem promover a ativação da DC e uma resposta protetora Th1 (SCHMITZ et al., 2014). As galectinas, receptores de lectina, também podem atuar como receptores de reconhecimento de patógenos e como moduladores da resposta inata e adaptativa (VASTA, 2009). Foi demonstrado que esses receptores são amplamente expressos em células B, macrófagos e DCs durante a infecção por T. cruzi (VRAY et al., 2004; ZÚÑIGA et al., 2001a, b). No que se refere às DCs, a galectina-1 parece ser um imunorregulador negativo que limita a resposta protetora do hospedeiro ao induzir circuitos tolerogênicos em DCs. Estas DCs tolerogênicas induzem a ativação das células T regulatórias, o que favorece a persistência do parasita nos tecidos do hospedeiro ou limita o dano tecidual colateral através da supressão das respostas inflamatórias (PONCINI et al., 2015). Galectina-3 (Gal-3) e seus ligantes específicos foram super-expressos em DC esplênicas após infecção por T. cruzi cepa Tehuantepec, o que levou ao aumento da adesividade e à redução da migração. Portanto, T. cruzi modula a funcionalidade de Gal-3 e seus ligandos para melhorar a infecção, outra propriedade imunomoduladora do T. cruzi (VRAY et al., 2004). 35 Outro receptor semelhante à lectina expresso por células do sistema imune, Siglec-E (lectina-E semelhante a imunoglobulina de ligação do ácido siálico), também tem sido implicado na infecção por T. cruzi. É bem sabido que a transferência do ácido siálico pela trans-sialidase (TS) do T. cruzi da célula hospedeira para moléculas semelhantes à mucina na superfície do parasita confere resistência ao complemento humano, contribuindo para a infecção (TOMLINSON et al., 1994). Além disso, como citado anteriormente na seção 1.2.1, Erdmann e colaboradores (2009) descreveram que a interação TS–Siglec-E resulta em um efeito inibidor na modulação das DCs, pela supressão da produção de citocina IL-12. Juntos, esses achados sugerem que o T. cruzi (ou produtos parasitários) pode levar à imunossupressão através de sua interação com os receptores de lectina da DC (TERRAZAS; TERRAZAS; GÓMEZ-GARCIA, 2010). Slamf1 (molécula de adesão auto-ligante - CD150) é uma molécula co- estimulatória presente na linhagem mielóide e necessária na interface das células apresentadoras de antígeno e células T (VAN DRIEL et al., 2016). Experiências in vitro e in vivo revelaram que as células mielóides deficientes em Slamf1 apresentaram produção alterada de citocinas e reduziram a replicação parasitária. Foi detectada uma produção de IFN- muito mais baixa no coração de camundongos deficientes em Slamf1 do que no coração de camundongos WT. Além disso, os camundongos deficientes em Slamf1 apresentaram danos cardíacos reduzidos apesar do número comparável de infiltrado de DCs, macrófagos, linfócitos T CD4+ e CD8+ em comparação com os animais WT. Portanto, o T. cruzi requer Slamf1 para se replicar nas DCs e sua ausência leva a uma menor produção de fatores específicos de células mielóides pelas DCs, que são compostos chave para a resposta imune e os resultados da infecção (CALDERÓN et al., 2012). 1.3.3 Células dendríticas humanas e Trypanosoma cruzi O primeiro experimento que confirmou a habilidade do T. cruzi infectar e reproduzir-se no interior das DCs humanas foi realizado em 1999 por Van Overtvelt e colaboradores. Os autores também demonstraram que as DCs derivadas de 36 monócitos e infectadas por T. cruzi cepa Tehuantepec, reduziram significativamente a expressão de CD40 e HLA-DR e não produziram IL-12 e TNF-. Outro estudo do mesmo grupo, que utilizou a mesma cepa de T. cruzi, mostrou que fatores solúveis liberados por T. cruzi no meio de cultura das DCs inibiram a expressão de MHC de classe I induzida por LPS, na superfície das DCs humanas. Esta inibição pode diminuir o efeito protetor de células T CD8+ específicas uma vez que as DCs infectadas apresentam uma menor capacidade de apresentação cruzada, o que poderia influenciar a capacidade in vivo do hospedeiro de combater a infecção eficientemente (VAN OVERTVELT et al., 2002). Sabe-se que a pequena família de glicoinositolfosfolipídeos (GPILs) é abundante na superfície de T. cruzi e que tais moléculas parecem apresentar atividade imunoregulatória (BRODSKYN et al., 2002; MEDEIROS et al., 2007). GIPLs isolados de T. cruzi cepas G (Tcl) e Y (TcII) foram incubados com DCs derivadas de monócitos estimuladas por LPS. Os resultados mostraram que antígenos GIPL direcionaram a regulação para baixo tanto de citocinas pró- inflamatórias, tais como IL-12 e TNF-, quanto de citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10. GIPLs do parasito também inibiram a expressão de moléculas co- estimulatórias HLA-DR, CD83, CD86, CD180 e CD40 na superfície das DCs (BRODSKYN et al., 2002). Resultados semelhantes foram encontrados quando a porção ceramida da molécula de GIPL foi utilizada para estimular as DCs, sugerindo que fragmentos de glicoproteínas do parasito poderiam representar uma estratégia de evasão do T. cruzi (BRODSKYN et al., 2002). A proteína da família tiol-disulfureto oxiredutase (Tc52) liga-se e induz a maturação da DCs tanto murina quanto humana, via ativação do TLR2. DCs derivadas de monócitos tratadas com Tc52 apresentaram uma expressão mais elevada de CD83, CD86, CD54 e HLA-DR e uma produção elevada de IL-8, MCP-1 e MIP-1. Esses dados in vitro sugerem que Tc52 pode proporcionar recrutamento local e ativação de leucócitos e então a migração da DC aos linfonodos, onde podem desencadear respostas de células T e B (OUASSI et al., 2002). Parasitas da cepa Tulahuen de T. cruzi aumentaram a expressão de CD40 e CD80 em mDCs de sangue de cordão umbilical em um nível mais elevado em comparação com mDCs de doadores adultos. A proliferação de células T CD8+ 37 também foi estimulada pelas mDCs de sangue de cordão umbilical (RODRÍGUEZ; CARLIER; TRUYENS, 2012a). Outro estudo, realizado pelo mesmo grupo, mostrou que o T. cruzi pode induzir a maturação da mDC sem infectá-la. Rodriguez, Carlier e Truyens (2012b) demonstraram que as mDCs de sangue de cordão umbilical e de adultos que tiveram contato com o parasito mas não foram infectadas, expressaram altos níveis de CD80 e CD83. Além disso, eles demonstraram que tanto mDC infectadas quanto lisados de T. cruzi co-incubados com mDCs levaram a uma expressão padrão semelhante de suas moléculas de superfície. Os autores mostraram também que a taxa de infecção nas mDCs foi menor que em monócitos e granulócitos, possivelmente devido à sua capacidade elevada de fagocitose quando comparadas com as DCs maduras (RODRÍGUEZ; CARLIER; TRUYENS, 2012b). A modulação da função da DC varia de acordo com a cepa de T. cruzi. Em um estudo comparativo, Magalhães e colaboradores (2015) demonstraram que a cepa Col cl1.7 (TcI) induz a super expressão de CD80 e CD86, ao contrário da cepa Y (TcII). A cepa Y (TcII) induz um aumento na produção de IL-10, TNF- e granzima A, enquanto que linfócitos T CD8+ ativados pela cepa Col cl1.7 produziram níveis elevados de IL-17. Resumindo, a cepa TcI foi capaz de uma maior ativação de monócitos, enquanto que a cepa TcII induziu um perfil mais inflamatório. O que se sabe até agora sobre a interação entre DCs humanas e T. cruzi se restringe a modelos in vitro, onde a expressão de algumas citocinas e moléculas de superfície foram analisadas, mas as funções específicas dos subtipos de DCs estão apenas no início de serem desvendadas. No entanto, parece que as cepas virulentas de T. cruzi provavelmente aproveitam-se das DCs suscetíveis para driblar a resposta imune do hospedeiro e instalar a infecção com sucesso. Desta forma, as DCs moduladas irão conduzir uma resposta adaptativa fraca com baixa expressão de moléculas do MHC de classe I e II e citocinas pró-inflamatórias, que são fundamentais para o controle da sobrevivência do parasita (ALBA SOTO et al. 2010; DA COSTA et al., 2014; PONCINI et al., 2008). 38 1.4 EICOSANOIDES Os eicosanoides são mediadores lipídicos sintetizados a partir do ácido araquidônico. Células da imunidade inata, incluindo macrófagos residentes, células dendríticas sentinelas e neutrófilos, são as maiores produtoras de eicosanoides (PHIPPS; STEIN; ROPER, 1991), que incluem as prostaglandinas (PGs), os leucotrienos (LTs) e as lipoxinas (LXs). Tais mediadores recebem especial atenção devido à sua importância na patogênese de diversas doenças inflamatórias e imunológicas (HARIZI, CORCUFF; GUALDE, 2008). A síntese de eicoasanoides pode ser ativada por diversos estímulos, como ação de fatores de crescimento, processo inflamatório ou trauma mecânico. Tais estímulos induzem a expressão e ativação da enzima fosfolipase A2 citosólica (cPLA2), a qual catalisa a liberação do ácido araquidônico (AA) endógeno da membrana citoplasmática (figura 5) (FUNK, 2001; SEIBERT et al., 1994) Figura 5. Metabolismo dos eicosanoides. Fonte: Adaptado de HARIZI; CORCUFF; GUALDE (2008). 39 O AA liberado da membrana pode ser metabolizado através de três vias enzimáticas distintas: (a) pela via da ciclooxigenase (COX), a qual será detalhada na próxima seção, (b) pela via da lipoxigenase (LO) produzindo leucotrienos (LTs), lipoxinas (LXs), o ácido hidroperoxieicosatetraenóico (HPETE) e o ácido hidroxieicosatetraenóico (HETE); e (c) pela via da citocromo p450 monooxigenase produzindo epóxi ácidos e 20-HETE (figura 5). Pode ocorrer ainda uma via não enzimática, onde o AA sofre peroxidação mediada por radicais livres gerando isoprostanos (BOTTING 2006a; HARIZI; CORCUFF; GUALDE, 2008; MACHADO et al., 2011; MEDEIROS et al., 2012; MORROW et al., 1990). 1.4.1 Via da ciclooxigenase e receptores prostanoides O AA sofre ciclização dependente de oxigênio pela enzima ciclooxigenase (COX) ou prostaglandina endoperóxido sintase (PGHS), para formar prostaglandina G2 (PGG2) que subsequentemente sofre a ação de peroxidase pela mesma COX sendo reduzida ao seu endoperóxido instável PGH2, a qual é convertida por sintases tecido específicas em outros prostanóides bioativos: PGD2, PGE2, PGF2, PGI2 (prostaciclina) e tromboxana A2 (TXA2) (figura 6) (BOTTING 2006a, MEDEIROS et al., 2012). As plaquetas sintetizam principalmente TXA2, enquanto que as células endoteliais produzem PGI2. PGD2 é produzida por mastócitos e no cérebro, enquanto que PGE2 é um mediador importante nas células renais e estomacais e no processo inflamatório (BOTTING, 2006b). Coletivamente esses produtos são chamados de prostanoides e os receptores que medeiam suas ações são os receptores de prostanoides (REGAN, 2003). 40 Figura 6. A cascata do ácido araquidônico – via da ciclooxigenase. Fonte: Adaptado de BOTTING (2006a). Os efeitos da PGE2 são exercidos por receptores PGE específicos na membrana plasmática das células alvo designados receptores EP (para receptores prostanóides E) (HALUSHKA, et al., 1989) que existem em quatro subtipos: EP1-4, (NARUMIYA; SUGIMOTO; USHIKUBI, 1999). PGF2, PGI2 e TXA2 exercem suas ações através de receptores FP, IP e TP, respectivamente. Os efeitos de PGD2 são mediados por dois receptores denominados DP1 e DP2, um GPCR recentemente descoberto, expresso em células Th2 e também conhecido como CRTh2. Este receptor liga tanto o PGD2 como o seu metabolito 15-desoxi PGJ2. A ligação de 15- desoxi PGJ2 resulta na liberação de cálcio intracelular, em oposição aos aumentos de AMPc que ocorrem quando PGD2 se liga ao seu receptor DP1 tradicional (HIRAI et al., 2001). Os receptores de prostanoides pertencem a três grupos (com base em atributos de homologia e sinalização, em vez de propriedades de ligação ao ligante) 41 dentro de tipos distintos da superfamília GPCR, proteínas com sete porções transmembranas. A única exceção é DP2, que é um membro do subgrupo de receptores de quimiocinas. Os receptores IP, DP1, EP2 e EP4, formam uma sinalização de cluster através de aumentos mediados por Gs no AMPc intracelular (COLEMAN et al., 1995; KATSUYAMA et al., 1995). Os receptores EP1, FP e TP, formam um segundo grupo que sinaliza através de aumentos mediados por Gq no cálcio intracelular. O receptor EP3 é considerado um receptor "inibitório". A sinalização pelo receptor EP3 é mais complexa devido às múltiplas isoformas do receptor EP3 geradas por splicing alternativo a partir de um único gene do receptor EP3. Estas isoformas de receptores EP3 são acopladas a diferentes vias de sinalização, incluindo Gi, Gs e cálcio. A existência de quatro subtipos de receptores para PGE2 é notável, dado que os outros prostanoides têm apenas um único receptor. Esta família complexa de receptores EP acoplados a sinais intracelulares distintos fornece uma base molecular para as diversas ações fisiológicas e, às vezes, antagônicas de PGE2 em uma variedade de tipos celulares (BREYER; BAGDASSARIAN, 2001). 1.4.1.1 Enzima ciclooxigenase Existem duas isoformas de COX, uma constitutiva (COX-1) e uma induzível (COX-2). A COX-1 está envolvida basicamente com funções fisiológicas, tais como regulação da secreção de muco gástrico, ativação plaquetária, tônus vascular e manutenção da função renal, enquanto que a COX-2 atua na inflamação, câncer e dano tecidual. Estas enzimas são o principal alvo de drogas anti-inflamatórias não esteroidais (AINES). Ambas as enzimas estão presentes no estado ativo no retículo endoplasmático e no envelope nuclear (HAEGGSTROM et al., 2010; MEDEIROS et al, 2012; ROUZER e MARNETT, 2008). COX-1 e COX-2 apresentam o mesmo peso molecular, 71 kDa, porém a sequência de aminoácidos da enzima COX-2 apresenta homologia de 60% com a COX-1. Ambas exibem uma estrutura tridimensional composta por três unidades independentes dobradas: um domínio N-terminal semelhante ao fator de crescimento epidermal, um domínio alfa hélice de ligação à membrana e um domínio globular C-terminal, o qual acomoda o sítio enzimático (BOTTING 2006a), tanto de 42 ciclooxigenase quanto de peroxidase, sendo que este último contém um cofator heme (SMITH; SONG, 2002). O sítio ativo, que consiste de um longo e estreito canal hidrofóbico, na COX- 2 é ligeiramente maior e pode acomodar estruturas maiores do que as que são capazes de se encaixar no sítio ativo da COX-1 (KURUMBAIL et al, 1996). Uma bolsa lateral interna secundária da COX-2 contribui significativamente para o maior volume do sítio ativo nesta enzima, embora o canal central também seja mais amplo em aproximadamente 17%. Essa diferença se dá pela variação na sequência de dois aminoácidos, Ile 523 é substituído por Val523 na COX-2 (figura 7). O acesso a este lugar é estericamente inadequado na COX-1 pela cadeia lateral longa de Ile523. Os locais de ligação do ácido araquidônico e AINES estão posicionados no meio superior do canal, Tyr385 e Ser530, enquanto que Arg120 fica na abertura do canal (BOTTING 2006a; GARAVITO; MALKOWSKI; DEWITT, 2002, KURUMBAIL et al, 1996). Figura 7. Sítio ativo da ciclooxigenase. EE = espaço extra. BL = bolsa lateral. Fonte: Adaptado de BOTTING (2006a). A atividade da COX é dependente da orientação apropriada do substrato no interior do sítio ativo, um processo que ocorre pela interação do AA com resíduos específicos de aminoácidos. Tyr385 que é catalítico e onde ocorre a remoção do 43 hidrogênio do C13 do AA, Gly533 e Tyr348, os resíduos que orientam o C13 para a remoção do hidrogênio; Arg120, o resíduo responsável pela interação eletrostática com o ânion carboxilato do AA, e os resíduos que governam a orientação do AA de tal forma a gerar PGG2, Val349, Trp387 e Leu534 (MALKOWSKI et al., 2000; RIEKE et al., 1999; THURESSON et al., 2001). 1.4.2 PGE2 e DCs PGE2 é uma das principais protaglandinas produzidas em grande quantidade pelas APCs ativadas, atuando como um regulador autocrino de sua atividade (RUSSELL; PACE, 1984; DUBOIS et al., 1998). Além de suprimir a proliferação de células T humanas (GOODWIN; BANKHURST; MESSNER, 1977; MINAKUCHI et al., 1990), inibir a produção de citocinas pró inflamatórias por macrófagos (SCALES et al., 1989; VAN DER POUW KRAAN et al., 1995) e inibir a expressão de moléculas de MHC de classe II (SNYDER; BELLER; UNANUE, 1982), a PGE2 é um modulador chave da função das DCs (HARIZI et al., 2001). PGE2 exerce diferentes efeitos dependendo do estado de maturação da DC. Nos tecidos periféricos, PGE2 parece exercer efeito estimulatório em DCs imaturas. De fato, PGE2 coopera com as citocinas inflamatórias tais como, TNF-, IL-1 e IL-6 promovendo a maturação da DC (KÚDELA et al., 2001; ZELLER-RIESER et al., 2002). DC maduras expressam o receptor de quimiocina CCR7 e migram através dos vasos linfáticos para órgãos linfoides em resposta a gradientes quimiotáticos dos ligandos de CCR7 (LUFT et al., 2002; SCANDELLA et al., 2002). Nos órgãos linfoides, PGE2 assume um papel regulatório, reduzindo a ativação da DC e sua habilidade em apresentar antígeno às células T (HARIZI et al., 2001). Outra ação estabelecida da PGE2 na função da DC é a regulação da produção de citocinas, dependendo do contexto e do microambiente. A presença de PGE2 durante o contato da DC com o antígeno, inibe completamente sua capacidade em produzir a citocina que direciona a resposta Th1, a IL-12. Essas DCs produzem altos níveis de IL-10 (KALINSKI et al., 1997), a qual é conhecida como uma citocina regulatória (VASSILIOU; JING; GANEA, 2003). Além de seu potencial para modular a maturação, a capacidade de produção de IL-12 e capacidade de polarização da resposta Th, existem novas evidências diretas de que PGE2 afeta a apoptose e a expressão do receptor de quimiocinas dessas APCs profissionais. Por exemplo, a 44 PGE2 inibe a produção de quimiocinas inflamatórias CCL3 e CCL4 na DC derivada de medula óssea murina (BM-DC). Ao diminuir a liberação de quimiocinas, a PGE2 pode atuar como um agente anti-inflamatório que previne o acúmulo excessivo de células imunes ativadas (JING; VASSILIOU; GANEA, 2003). Estudos anteriores relataram que a PGE2 pode atuar em células de maneira paracrina e desempenhar um papel crucial na interação célula/célula. Por exemplo, a PGE2 derivada de monócitos tem efeitos supressivos na função APC de DC in vivo. Usando indometacina (inibidor de COX), Bjercke e Gaudernack (1985) forneceram evidências de que a função APC da DC pode, pelo menos em parte, ser atribuída à maior produção de PGE2 por monócitos. 1.5 ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO ESTEROIDAIS Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) foram nomeados dessa forma para distingui-los dos antiinflamatórios esteroidais, também usados para inibir o processo inflamatório. O AINE mais antigo é a aspirina ou ácido acetilsalicílico (ASA), com ações anti-inflamatória, analgésica e antipirética, além de apresentar efeitos colaterais como dano à mucosa gástrica, toxicidade renal e inibição da agregação plaquetária (BOTTING, 2010). 1.5.1 Aspirina Originalmente obtida a partir de fontes vegetais, a aspirina foi primeiro sintetizada pelo alemão Felix Hoffman na Bayer Company em 1897, mas seu mecanismo de ação foi desvendado somente em 1971 por John R. Vane, que na época, demonstrou a inibição dose dependente da síntese de prostaglandina. Por suas descobertas em relação às prostaglandinas e substâncias biologicamente ativas relacionadas, Vane recebeu o prêmio Nobel no ano de 1982. A partir de 1971 vários estudos foram realizados para entender melhor o mecanismo de ação desse AINE que inibe a atividade da COX (BOTTING, 2006a). O resíduo de serina na molécula da COX é o alvo da aspirina, que acetila o seu grupo hidroxila inibindo a ligação do AA, inibindo irreversivelmente a COX. Enquanto na COX-1 o resíduo Ser530 é acetilado, na COX-2 é o resíduo Ser516 45 (BOTTING, 2006b; VANE; BOTTING, 2003). A acetilação do resíduo Ser516 na COX-2 causa um impedimento estérico que limita o espaço disponível para acomodar a porção final da longa cadeia de carbonos do AA, distorcendo o AA no sítio ativo, o qual então é convertido em ácido 15(R)-hidroxieicosatetraenóico (15R- HETE). O 15R-HETE sofre a ação da 5-LO que o converte em 15-epi-lipoxinas, as chamadas lipoxinas desencadeadas pela aspirina (ATLs) (figura 8) (LECOMTE et al., 1994; SCHNEIDER; BRASH, 2000). Figura 8. Esquema da ação da aspirina sobre a ciclooxigenase. Fonte: Adaptado de www.researchgate.net/journal/0080- 0015_Recent_results_in_cancer_research. As ATLs levam à ativação da cascata de síntese das protectinas e resolvinas, as quais tem o efeito de inibir a migração e a síntese de IL-12 pelas DCs (SERHAN, CHIANG e VAN DYKE, 2008; SERHAN, YACOUBIAN e YANG, 2008). 46 Essas respostas celulares ativadas pelas ATLs resultam de sua interação com seu receptor específico (ALX), um receptor acoplado à proteína G para eicosanoides derivados da lipoxigenase (BENNETT; GILROY, 2016; SCHWAB; SERHAN, 2006). A inibição eficiente da aspirina depende de sua ligação ao resíduo de Arg120 na COX (GARAVITO; DEWITT, 1999). A aspirina inicialmente forma uma ponte de hidrogênio entre seu grupamento carboxila e o resíduo de Arg120, o que coloca a molécula na orientação correta para causar a acetilação do resíduo de serina (TOSCO; LAZZARATO, 2009). A aspirina também apresenta efeitos por mecanismos independentes de COX, os quais incluem a indução da síntese de NO (TAUBERT et al., 2004), aumento da produção de adenosina pelo estímulo da hidrólise de ATP (CRONSTEIN; MONTESINOS; WEISSMANN, 1999; CRONSTEIN et al., 1994) e a inibição da via de transcrição do fator nuclear kapa B (NF-B) (KOPP; GHOSH, 1994). 1.5.2 Celecoxibe Os efeitos colaterais gástricos são os principais problemas dos AINEs não seletivos que atuam preferencialmente sobre a COX-1, como é o caso da aspirina. Devido a isso, a indústria farmacológica buscou desenvolver AINEs seletivos para COX-2. Assim, em 1999 surgiram os primeiros, o celecoxibe (Celebrex) e o rofecoxibe (Vioxx) (BOTTING, 2006a). A estrutura química do celecoxibe contém um grupamento sulfonamida no lugar do grupo carboxila da aspirina (figura 9). Tal grupamento do celecoxibe liga-se ao resíduo de Arg513 no sítio catalítico da COX-2 (BOTTING, 2006b). Embora não tenha efeitos gastrotóxicos, o celecoxibe apresenta efeitos cardiovasculares como demonstrado em estudos realizados por Solomon e colaboradores em 2005. Tal efeito é causado pela inibição da síntese da molécula anti-agregante plaquetária prostaciclina pelas células endoteliais sem atuar sobre a pró-trombótica tromboxana nas plaquetas (MCADAM et al., 1999). 47 Figura 9. Estrutura química da aspirina (esquerda) e do celecoxibe (direita). Fonte: Domínio público. Inicialmente o celecoxibe foi desenvolvido para o tratamento da dor crônica, porém vários autores demonstraram que é capaz de exercer efeitos independentes da inibição de COX-2, como por exemplo, atividade antitumoral pela modulação do citoesqueleto de actina que inibe a migração (BEHR et al, 2015), indução da apoptose de células tumorais (SCHÖNTHAL, 2007) e diminuição da sobrevida pela inibição do ciclo celular (GRÖSCH et al., 2001; GRÖSCH et al., 2006). Em relação à resposta imune, além do efeito inibitório sobre a COX-2, Alloza e colaboradores (2006) demonstraram que celecoxibe e seu análogo [1-(4-sulfamoyl phenyl)-3-trifluoromethyl-5-(4-trifluoromethylphenyl) pyrazole inibem a expressão de IL-12 por aumentarem sua associação com a chaperona calreticulina, promovendo sua permanência no retículo endoplasmático em células 3H10-HEK. CHIBA e cols. (2012) demonstraram o mesmo efeito em macrófagos derivados de células U937 humanas e ativados por LPS. Ainda, a apoptose induzida pelo celecoxibe deriva da inibição da bomba de cálcio da membrana do retículo endoplasmático, aumentando os níveis citosólicos de cálcio que ativam os mecanismos de morte associados ao retículo endoplasmático (SCHÖNTHAL, 2007). 1.6 EICOSANOIDES e Trypanosoma cruzi O T. cruzi é capaz de sintetizar lipídios bioativos no cinetoplasto e sua síntese é regulada assim como nos mamíferos. O parasito não apresenta todas as vias sintéticas completamente, entretanto, é capaz de sintetizar ácidos graxos poliinsaturados a partir de precursores presentes no hospedeiro mamífero, como o 48 AA e o ácido eicosapentaenóico (LIVORE, TRIPODI; UTTARO, 2007; MACHADO et al., 2011). A enzima PLA2 similar à dos humanos está presente e cliva a cadeia acil do AA presente nas membranas. Além disso, esta enzima é dependente de cálcio e sua atividade está aumentada nas formas infectantes do parasito. Assim, quando a enzima atua, ocorre a mobilização intracelular de cálcio e a ativação de diacilglicerol (DAG) e lisofosfatidilcolina, os quais ativam as proteínas quinases. Esse processo de sinalização é critico para ocorrer a interação parasito-célula hospedeira que antecede a invasão (Revisado por MACHADO et al, 2011). O T. cruzi também apresenta a fosfolipase A1 (Tc-PLA1) que atua sobre os lipídios da célula hospedeira para gerar mensageiros secundários lipídicos (DAG, ácidos graxos livres, lisofosfolipídios) e concomitante ativação da proteína quinase C (PKC). A PKC tem sido implicada no aumento da invasão, sugerindo que a Tc-PLA1 está envolvida nos estágios iniciais da interação parasito-hospedeiro que antecedem a invasão (BELAUNZARÁN et al., 2007). Em relação à síntese de prostanóides, T. cruzi sintetiza preferencialmente TXA2 (ASHTON et al., 2007), pequenas quantidades de PGF2 e quantidades insignificantes de PGD2. A enzima PGF2 sintase é semelhante à enzima amarela velha de levedura (“yeast old yellow enzime”) (TcOYE) e resistente a AINEs como aspirina e indometacina (KABUTUTU et al., 2003). A ação da lipoxina na inflamação do miocárdio e na resposta a infecção por T. cruzi não é bem compreendida. As únicas evidências que permitem extrapolar o seu papel na regulação da infecção por protozoários são os estudos dos mecanismos da lipoxina na infecção por Toxoplasma gondii. Animais que apresentavam a infecção por T. gondii e nocautes para a enzima lipooxigenase (5- LO), apresentaram um aumento significativo dos níveis de IL-12 e IFN-, enquanto que os animais onde ocorreu a administração da lipoxina A4 não se verificou o aumento. Os animais nocautes apresentaram também danos teciduais e maior mortalidade em relação aos controles selvagens (ALIBERTI; BAFICA, 2005; MACHADO; ALIBERTI, 2006; MUKHERJEE et al., 2011). No modelo de infecção por T. gondii foi demonstrado que a lipoxina ativa dois receptores de células dendríticas (AhR -Receptor aril hidrocarbono e LXAR) e os efeitos da ativação são a expressão do supressor de citocinas sinalizante 2 49 (SOCS-2). Este supressor está relacionado com a modulação da inflamação na infecção por T. gondii (ALIBERTI; BAFICA, 2005; MACHADO; ALIBERTI, 2006; MUKHERJEE et al., 2011). Wirth e Kierszenbaum em 1985 observaram a relação dos leucotrienos B4 e C4 na infecção por T. cruzi com a estimulação da fagocitose e consequentemente maior entrada do parasito em monócitos. A inibição da enzima lipooxigenase pode ocorrer pela ação do ácido nordihidroguairético, que impede a formação de leucotrienos. O ácido nordihidroguarético também é inibitório para TGF- (fator de transformação de crescimento beta) que desempenha diversas funções no controle da infecção por T. cruzi na progressão da doença de Chagas (DIAS, 1979; DIAS, 2006). Os leucotrienos parecem exercer papel essencial no controle da carga parasitária tanto no sangue como no coração, no desenvolvimento do estresse oxidativo e na regulação da produção de óxido nítrico por macrófagos ativados na fase aguda da infecção experimental com T. cruzi (BORGES et al., 2009; PANIS et al., 2011). Entretanto, o estudo realizado por Pavanelli e colaboradores (2010) mostrou que a ausência de leucotrienos também parece exercer uma função protetora contra a infecção. Utilizando camundongos nocautes para 5-LO infectados com T. cruzi, encontraram uma parasitemia inicial mais elevada, porém uma melhora da taxa de sobrevivência dos camundongos, explicada pela redução dos níveis de citocinas e infiltrado inflamatório no coração, em comparação com os camundongos selvagens. O tromboxano A2 (TXA2) é um potente vasoconstritor e está relacionado com muitas das sequelas provocadas da doença de Chagas como: inflamação dos órgãos e lesão isquêmica. A expressão TXA2 promove citocinas pró-inflamatórias, quimioquinas, moléculas de adesão e a endotelina-1 que promovem lesão tecidual (ASHTON et al., 2007). Na infecção por T. cruzi em camundongos nocautes para o receptor TXA2, apresentaram elevada inflamação no miocárdio e também na carga parasitária no tecido cardíaco (ASHTON et al., 2007). Durante a fase aguda da infecção por T cruzi o TXA2 auxilia na sobrevida do hospedeiro para que este faça a transição para a fase crônica (ASHTON et al 2007). A PGE2 tem efeito depressor na resposta humoral, inibindo a diferenciação dos linfócitos B em plasmócitos secretores de anticorpos e efeito inibitório nas células T (TILLEY; COFFMAN; KOLLER, 2001). 50 As prostaglandinas são essenciais na modulação observada na infecção de T. cruzi tendo efeito imunossupressor (PINGE-FILHO; TADOKORO; ABRAHAMSOHN, 1999). Em um experimento analisando a ação inibitória de COX observou-se que atenuava a lipoperoxidação, isto é, a oxidação dos ácidos graxos nos eritrócitos no início (fase aguda) da infecção com T cruzi (TATAKIHARA et al, 2008). Estudos com camundongos infectados com T. cruzi (fase aguda) e tratados com a aspirina (inibidor generalista de COX-1 e COX-2) apresentaram maior parasitemia e mortalidade o que não foi observado na fase crônica. Na resposta ao T. cruzi a aspirina inibiu o aumento dos níveis de PGF2 e TXA4. Foi relatado na infecção de T. cruzi, que a aspirina potencializou o efeito do nifurtimox e benzonidazol quando inibiu a síntese de prostaglandinas, aumentando a atividade do macrófago para eliminação do parasita (LÓPEZ-MUÑOZ, et al., 2010). Foi demostrado por Malvezi e colaboradores em 2014 que o tratamento de células H9c2 (cardiomiócitos de ratos) tanto com aspirina como celecoxibe aumentaram a expressão de iNOS, corroborando com a hipótese de que a inibição das enzimas COXs aumentaria os níveis de óxido nítrico recompondo a atividade antiparasitária dos macrófagos. 1.6.1 Aspirina e Células Dendríticas A funcionalidade das DCs pode ser regulada pelos eicosanoides. Já foi descrita a participação de PGD2, PGE2 e LTC4 na maturação, quimiotaxia e migração das DCs (LANDI, BABIUK, VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK, 2011; POLOSO et al., 2013; ROBBIANI et al., 2000; SCANDELLA, et al., 2002; SCANDELLA, et al., 2004). Além da citocina IL-12, outra citocina sofre influência dos eicosanoides. A expressão de TNF- pelas DCs murinas pode ser inibida por PGE2 (HARIZI; GUALDE, 2004; VASSILIOU; JING; GANEA, 2003). Várias evidências in vitro e in vivo mostraram que ASA exerce profundos efeitos na maturação e diferenciação de células dendríticas através de seus mecanismos independentes de COX. 51 Hackstein e colaboradores (2001) demonstraram que o tratamento de DCs derivadas de medula óssea murina com aspirina inibiu a expressão de moléculas co- estimulatórias CD40, CD80, CD86 e MHC-II, além disso, o tratamento aumentou a atividade endocítica, característica de DC imatura, não inibiu a migração das DCs aos linfonodos secundários, porém, inibiu a estimulação da proliferação de células T virgens e a expressão de IL-12. De acordo com esses autores, tais efeitos foram causados pelo efeito inibitório de ASA sobre o NF-B. Os efeitos de ASA encontrados por Hackstein e cols. (2001) também foram observados em DCs derivadas de monócitos humanos nos estudos realizados por Bufan e colaboradores (2009) e por Matasic; Dietz; Vuk-Pavlovic (2000). A aspirina e ATLs são capazes de inibir a síntese de citocinas pró inflamatórias pelas DCs através da expressão do supressor da expressão de sinalização de citocinas 2 (SOCS-2) (MACHADO et al., 2008). Kim e colaboradores (2010) trataram DCs derivadas de medula óssea murina com altas doses de aspirina por 18 horas e observaram que houve inibição da expressão tanto de MHC-I quanto de MHC-II e concluíram que o efeito anti- inflamatório da aspirina se dava pela inibição da apresentação de antígenos via MHC às células T. Resumidamente, os efeitos supressivos acima descritos de ASA sobre o processo de maturação, bem como sobre a subsequente atividade imunoestimulante de DCs sugerem seu potencial imunorregulador sobre as respostas imunes inatas e adaptativas. 1.7 ADENILATO CICLASE A adenilato ciclase (AC) é uma proteína integral de membrana composta por dois domínios transmembrana de seis alfas hélices cada um e dois domínios citosólicos denominados C1 e C2. Os domínios citosólicos constituem o centro catalítico da enzima, onde ocorre a conversão de ATP em adenosina-3’-5’ monofosfato ou AMP cíclico (AMPc) (PIERRE et al., 2009; SADANA; DESSAUER, 2009; SUNAHARA; TAUSSIG, 2002). A atividade da AC é regulada por receptores acoplados à proteína G (GPCRs). As proteínas G são heterotriméricas, compostas por subunidades ,  e , 52 e classificadas de acordo com a estrutura e sequência da subunidade , sendo que as três principais isoformas são a Gs (estimulatória), que ativa a AC, a Gi (inibitória) que inibe a atividade da AC e a Gq, envolvida na ativação da enzima fosfolipase C. Assim, a ativação de Gi geralmente resulta em resposta pro-inflamatória, por inibir a produção de AMPc, enquanto que a ativação de Gs geralmente contribui com uma resposta anti-inflamatória, por aumentar os níveis intracelulares de AMPc (revisado por LEANDER; FRIEDMAN, 2014). As três subunidades da proteína G permanecem associadas no estado inativo, sendo tal associação essencial para a ativação estimulada por receptor. Em resposta ao ligante de GPCR, a subunidade Gs catalisa a troca de GDP por GTP, assumindo a forma ativa dessa isoforma, desloca-se do dímero  e ativa a AC, resultando no aumento do AMPc (CABRERA-VERA et al, 2003). O aumento na concentração do AMPc intracelular resulta na ativação da proteína PKA (proteína quinase dependente de AMPc), que em seguida pode fosforilar diversas proteínas intracelulares que respondem ao estímulo gerado pelo ligante ao GPCR (CABRERA-VERA et al., 2003). O dímero  além de ancorar a fração , está ligado aos processos de endocitose mediados por receptores. Lin e colaboradores (1998) demonstraram que o sequestro do dímero  por subunidades  mutantes, resultou na diminuição da formação de vesículas revestidas por clatrina, proteína responsável pela formação das vesículas membranares nas células. Existem nove isoformas da AC ligadas à membrana e uma isoforma solúvel, a AC10, em humanos. Tais isoformas diferem em suas propriedades farmacológicas. As isoformas AC-1, AC3 e AC8 são estimuladas pela via do cálcio/calmodulina. As isoformas AC2, AC4, AC5, AC6 e AC7 são estimuladas pelas subunidades do grupo das proteínas G. AC5 e AC6 são inibidas tanto pelo cálcio quanto pela proteína G inibitória Gi. AC9 não responde à forscolina, um potente ativador da AC (Revisado por EMERY; EIDEN; EIDEN, 2013). O efeito ativador do diterpeno forscolina (FSK) resulta de sua ligação ao resíduo de leucina presente nos domínios catalíticos C1 e C2 da AC. AC9 apresenta uma mutação pontual nesse local, representado pela troca da leucina por uma tirosina, o que resulta na insensibilidade dessa isoforma à forscolina (YAN et al., 1998). 53 As nove isoformas são responsáveis pela produção do AMPc, porém a finalização da sinalização do AMPc é realizada por uma grande subfamília de enzimas, incluindo as mais de 40 variantes da enzima fosfodiesterase (PDE), a qual cataliza a degradação do AMPc em AMP (revisado por KLOTZ; KACHLER, 2016). A concentração intracelular de AMPc é regulada pelo equilíbrio entre as ações das ACs e das PDEs, que estabelecem um “pool” local de AMPc próximo às moléculas efetoras. Essa compartimentalização do AMPc é possível pela ação das proteínas ancorantes de PKA (AKAPs) (Revisado por PIDOUX; TASKÉN, 2010). Enquanto a atividade da AC é regulada pela G, a atividade da PDE é regulada pela enzima PKA, que sofre realimentação da G (LEANDER; FRIEDMAN, 2014). A enzima PKA ativada pelo AMPc pode ativar o fator de transcrição da proteína ligada ao elemento de resposta do AMPc (CREB), resultando na transcrição de genes que possuem o elemento CRE, ou seja, os genes de IL-2, IL-6, IL-10, TNF-  e COX-2 (revisado por WEHBI; TASKÉN, 2016). 1.7.1 AMPc e células dendríticas AMPc é conhecidamente um inibidor da ativação celular. Kambayashi, Wallin e Ljunggren (2001), Galgani e colaboradores (2004) e Ozegbe e colaboradores (2004), demonstraram que ativadores da produção de AMPc tais como FSK e PGE2, inibem a ativação de DCs mediada por TLR e consequentemente sua função. Além disso, o AMPc é capaz de induzir a expressão de IL-10, conferindo um fenótipo tolerogênico nestas células (EIGLER et al, 1998; FUJITA et al., 2006; HAMMAD et al, 2007). Schnurr e colaboradores (2005) demonstraram que FSK e PGE2 aumentaram os níveis de AMPc através dos receptores EP2/EP4 (receptores ligados à Gs), resultando na diminuição dos níveis de IL-12 e aumento nos níveis de IL-23 em MdDCs. Usando análogos de AMPc específicos para PKA ou para EPAC, Garay e colaboradores (2010) demonstraram que a ativação seletiva de PKA pelo AMPc induziu a maturação de DCs derivadas de monócitos humanos. Por outro lado, quando as duas vias, tanto a da PKA quanto a da EPAC foram ativadas 54 simultaneamente, a EPAC suprimiu o efeito da PKA, sugerindo que essas enzimas atuam regulando as funções das DCs. 1.7.2 AMPc e T. cruzi A AC tripanosomatida (TcAC) localizada na membrana da região flagelar do parasito, apresenta uma pequena sequência homóloga com a AC humana mas uma estrutura completamente diferente. A TcAC tem um único domínio catalítico altamente conservado, um domínio transmembrana e um grande domínio N-terminal variável extracelular, estrutura que lembra o receptor de guanilato ciclase. O domínio catalítico não é estimulado pela forscolina (BAO et al, 2010; TAGOE; KALEJAIYE; DE KONING, 2015). Tanto a TcAC quanto o AMPc estão envolvidos no processo de diferenciação das formas epimastigotas para tripomastigotas metacíclicos (D’ANGELO et al., 2002). Segundo Naula e Seebeck (2000), os níveis de AMPc aumentam de três a quatro vezes antes da diferenciação. Além disso, o AMPc está envolvido na proliferação celular do T. cruzi. Níveis elevados de AMPc inibem a síntese de DNA, RNA e proteínas (SANTOS; OLIVEIRA, 1988). O T. cruzi possui a enzima PKA dependente de AMPc e sua inibição induz a morte celular de formas epimastigotas (BAO et al, 2008; GOLDENBERG; ÁVILA, 2011). Existem quatro grupos de PDE nos tripanosomatídeos, estruturalmente semelhantes às PDEs humanas. A exata função das PDEs do parasito permanecem sob investigação e o que se conhece baseia-se em sua localização celular, no complexo vacúolo contrátil (CVC), uma organela essencial para a sua virulência, uma vez que controla a osmorregulação (DOCAMPO et al., 2011; LAXMAN; BEAVO, 2007; PROCÓPIO; BARROS; MORTARA, 1999; TALVANI et al., 2002). O estudo sobre o papel da ciclooxigenase e do AMPc na infeção de células imunes humanas por T. cruzi pode propiciar novas perspectivas terapêuticas para a doença de Chagas. 55 2 JUSTIFICATIVA As Dcs exercem a função de adaptadores da imunidade inata e adquirida e são também altamente susceptíveis às vias da COX e do AMPc. Portanto, a compreensão dos mecanismos de regulação exercidos pelas enzimas COX-1 e COX-2 e sua relação com a produção de AMPc nas DCs é de grande importância fisiopatológica, clínica e terapêutica para a doenças de Chagas. 56 3 OBJETIVOS 3.3 OBJETIVO GERAL O objetivo geral do nosso estudo foi verificar o papel das COX 1 e 2 e da adenilato ciclase na infecção de células do sangue humano periférico enriquecidas com células dendríticas por Trypanosoma cruzi. Para isto utilizamos fármacos inibidores de COX e inibidores e ativadores de adenilato ciclase. 3.4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Investigar os efeitos da inibição das COX 1 e 2 (COX-1 e COX-2) sobre a invasão de células do sangue humano periférico enriquecidas com DCs (DC-PBMC) por formas tripomastigotas de cultura (TMC); Investigar os efeitos da inibição e da ativação da enzima AC sobre a invasão de DC-PBMC por TMC; Avaliar os efeitos da inibição de COX-1 e COX-2 sobre a produção de citocinas e NO por DC-PBMC infectadas por T. cruzi; Testar a hipótese de que o AMPc é um controlador da função tripanocida exercida por DC-PBMC e está sujeito às ações de mediadores lipídicos e do NO. 57 ARTIGO CIENTÍFICO 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Figure S1 69 Figure S2 70 CONCLUSÃO Os dados obtidos mostram que tripomastigotas internalizados por DC- PBMCs são capazes de sobreviver intracelularmente durante a infecção levando a uma resposta inflamatória. A modulação farmacológica dos níveis de PGE2 e AMPc pode influenciar as funções imunológicas das DCs humanas e alterar o curso da infecção in vitro por T. cruzi. Este estudo fortalece a ideia de que a via da COX-2 desempenha um papel fundamental no processo de invasão do T. cruzi. Assim, uma compreensão mais profunda do mecanismo de ação dos AINEs pode fornecer pistas para um novo alvo terapêutico para a doença de Chagas. 71 REFERÊNCIAS ABRAHAMSOHN, I. A.; COFFMAN, R. L. Trypanosoma cruzi: IL-10, TNF, IFN- gamma, and IL-12 regulate innate and acquired immunity to infection. Exp. Parasitol., 84: 231-244, 1996. ABUHAB, A.; TRINDADE, E.; AULICINO, G. B.; FUJII, S.; BOCCHI, E. A.; BACAL, F. Chagas' cardiomyopathy: The economic burden of an expensive and neglected disease. Int. J. Cardiol., 168 (3): 2375-80, 2013. AGÊNCIA FIOCRUZ DE NOTÍCIAS. Encontro discute lacunas e desafios para a doença de Chagas na atualidade. 2013. 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